rna干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株hc

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1、RNA干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株HC【摘要】目的探讨存活素(survivin)干扰提高结肠癌细胞株HCT116对顺铂(CDDP)敏感性的有关机制。方法在HCT116细胞中，用lipofectamine2000转染survivin的siRNA序列;荧光定量PCR检测survivinmRNA的表达;EM、Trizol购自Invertrogen公司。胎牛血清购自四季青公司。AnnexinVPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒均购自凯基公司。青链霉素、胰酶购自

2、吉诺公司。荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。Survivin抗体购于SantaCruz公司。内参βactin、辣根过氧化物标记二抗购自北京中山公司。siRNA由上海吉玛公司合成。细胞购于生科院细胞所。CDDP购自山东齐鲁制药厂。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及转染HCT116细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L链霉素)中,37℃，5%CO2培养箱中培养。HCT116细胞接种于六孔培养板中，接种24h后使用Lipof

3、ectamine2000进行转染。分别转染阴性对照siRNA与survivin特异性siRNA5′GGACCACCGCAUCUCUACATT3′。　　1.2.2AnnexinVPI检测细胞凋亡收集1×105细胞PBS洗涤2次，以200μl的BindingBuffer悬浮细胞;加入5μlAnnexinvFITC混匀，加入5μlPI混匀。室温避光15min，流式细胞仪检测。　　1.2.3使用Trizol提取细胞总RNA6孔培养板每孔中加入1ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3min后将细胞裂解物移入1

4、.5ml的EP管内。静置5min后每1ml的Trizol加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15s并将其置于室温下孵育5min。在4℃下以4200r/min高速冷冻离心15min。将水样层移到一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，混合后将样品冰盒上放置30min使RNA析出，在4℃下以4200r/min高速冷冻离心10min。移去上层悬液，用1ml的75%乙醇再洗涤RNA1次，将75%乙醇移去，简单干燥RNA沉淀，用无RNA酶水溶解RNA，并在56℃孵育5min。1∶50稀释测定浓度，样品保存于-

5、80℃。　　1.2.4RTPCR检测SurvivinmRNA的表达，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成，序列为:5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTCC3′(正链)，5′TCGATGGCACGGCGCACTTT3′(反链)和βactin5′TGGCACCACACCTTCTACAAT3′(正链)，5′AGAGGCGTACAGGGATAGCA3′(反链)。反应体系使用Takara公司试剂盒，反转录反应条件42℃，15min;85℃，5s。PCR反应条件95℃，10s，1个循环;95℃5s

6、，60℃20s，40个循环。F(Fold)=2-△△CT,△△CT=(CT.TargetCT.Actin)treated(CT.TargetCT.Actin)control。　　1.2.5全细胞蛋白提取预冷的PBS轻轻洗涤瓶中贴壁的细胞，6孔培养板每孔中加入100μl细胞裂解液融解细胞，同时用细胞刮子收集细胞，以上在冰上操作，细胞裂解液进行离心沉淀，取上清测其总蛋白浓度，剩余冻存于70℃待用。　　1.2.6免疫印迹检测survivin蛋白的表达提取总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂

7、奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜5min×4，二抗室温孵育1h，ECL发光试剂盒显色，曝光。　　1.3统计学处理采用SPSS11.5软件，计量资料以x±s表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析(oneRNA表达的影响survivin特异性siRNA转染48h后，RTPCR检测survivin在mRNA水平上的表达变化，阴性对照组细胞和对照组细胞相比(97.57%与100%)无明显变化，而survivin特异性siRNA干扰组则下降了68.4%，与对照组及阴性对照组比均有明显降低(P<

8、0.05)。见图1。　　与阴性对照组比较：1)P<0.05　　图1HCT116细胞survivinmRNA表达的变化　　图2HCT116细胞survivin蛋白表达的变化2.2RNA干扰对survivin蛋白表达的影响survivin特异性siRNA转染60h后，l)CDDP处理24h，流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。阴性对照组细胞，CDDP处理组(5.18%)与未处理组(5.65%)细胞凋亡无显著差