rna干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株hct116凋亡的影响

《rna干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株hct116凋亡的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、RNA干扰抑制存活表达对顺铂诱导结肠癌细胞株HCT116凋亡的影响【关键词】存活素;siRNA;细胞凋亡存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族中的最小成员〔1〕，因其抑制凋亡的作用很强，在肿瘤的研究中有重要价值〔2〕。Survivin在结肠癌组织中过度表达，对结肠癌的发生与发展过程中起重要作用〔3，4〕。近年来研究发现survivin与抗肿瘤药物的耐药性密切相关〔5〕。因此本实验使用RNA干扰技术降低survivin在结肠癌细胞株HCT116中的表达，检测survivin表达抑制细胞对低浓度化疗药物顺铂(CDDP)的敏感性，探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物CD

2、DP作用不敏感的产生及可能机制。　　1材料与方法　　1.1试剂DMEM、Trizol购自Invertrogen公司。胎牛血清购自四季青公司。AnnexinVPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒均购自凯基公司。青链霉素、胰酶购自吉诺公司。荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。Survivin抗体购于SantaCruz公司。内参βactin、辣根过氧化物标记二抗购自北京中山公司。siRNA由上海吉玛公司合成。细胞购于生科院细胞所。CDDP购自山东齐鲁制药厂。　　1.2方法　　1.2.1细

3、胞培养及转染HCT116细胞在DMEM培养液(含10%胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L链霉素)中,37℃，5%CO2培养箱中培养。HCT116细胞接种于六孔培养板中，接种24h后使用Lipofectamine2000进行转染。分别转染阴性对照siRNA与survivin特异性siRNA5′GGACCACCGCAUCUCUACATT3′。　　1.2.2AnnexinVPI检测细胞凋亡收集1×105细胞PBS洗涤2次，以200μl的BindingBuffer悬浮细胞;加入5μlAnnexinvFITC混匀，加入5μlPI混匀。室温避光15min，流

4、式细胞仪检测。　　1.2.3使用Trizol提取细胞总RNA6孔培养板每孔中加入1ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3min后将细胞裂解物移入1.5ml的EP管内。静置5min后每1ml的Trizol加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15s并将其置于室温下孵育5min。在4℃下以4200r/min高速冷冻离心15min。将水样层移到一干净的EP管中，加入等体积的异丙醇，混合后将样品冰盒上放置30min使RNA析出，在4℃下以4200r/min高速冷冻离心10min。移去上层悬液，用1ml的75%乙醇再洗涤RNA1次，将75%乙醇移去，简单干燥RNA沉淀

5、，用无RNA酶水溶解RNA，并在56℃孵育5min。1∶50稀释测定浓度，样品保存于-80℃。　　1.2.4RTPCR检测SurvivinmRNA的表达，引物均由上海英俊生物技术有限公司合成，序列为:5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTCC3′(正链)，5′TCGATGGCACGGCGCACTTT3′(反链)和βactin5′TGGCACCACACCTTCTACAAT3′(正链)，5′AGAGGCGTACAGGGATAGCA3′(反链)。反应体系使用Takara公司试剂盒，反转录反应条件42℃，15min;85℃，5s。PCR反应条件95℃，1

6、0s，1个循环;95℃5s，60℃20s，40个循环。F(Fold)=2-△△CT,△△CT=(CT.TargetCT.Actin)treated(CT.TargetCT.Actin)control。　　1.2.5全细胞蛋白提取预冷的PBS轻轻洗涤瓶中贴壁的细胞，6孔培养板每孔中加入100μl细胞裂解液融解细胞，同时用细胞刮子收集细胞，以上在冰上操作，细胞裂解液进行离心沉淀，取上清测其总蛋白浓度，剩余冻存于70℃待用。　　1.2.6免疫印迹检测survivin蛋白的表达提取总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，T

7、BST洗膜5min×4，二抗室温孵育1h，ECL发光试剂盒显色，曝光。　　1.3统计学处理采用SPSS11.5软件，计量资料以x±s表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析(oneRNA表达的影响survivin特异性siRNA转染48h后，RTPCR检测survivin在mRNA水平上的表达变化，阴性对照组细胞和对照组细胞相比(97.57%与100%)无明显变化，而survivin特异性siRNA干扰组则下降了68.4%，与对照组及阴性对照组比均有明显降低(P<0.05)。见图1。　　2.3RNA干扰细胞对低浓度CDDP敏感性的影响RNA干扰细胞与阴