临床医学毕业论文齐墩果酸对顺铂耐药胃癌sgc7901细胞增殖及细胞凋亡的影响.doc

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1、XX大学毕业论文齐墩果酸对顺钳耐药胃癌SGC7201细胞增殖及细胞凋亡的影响姓名：2014年6月25日齐墩果酸对顺钳耐药胃癌SGC7901细胞增殖及细胞凋亡的影响作者：李鸿梅王敬春齐占朋周丽兴桂华刘吉成【摘要】FI的探讨齐墩果酸(OA)对顺钳耐药胃癌SGC7901(SGC7901/CDDP)细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法体外诱导建立人胃癌顺钳耐药细胞株SGC7901/CDDP,MTT比色法检测OA对SGC7901/CDDP细胞增殖的抑制作用;琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的降解;蛋口质免疫印迹检测凋亡相关蛋口酶的激活

2、。结果MTT实验证明OA对SGC7901/CDDP细胞的生长有抑制作用，100gmol/LOA作用72h对SGC7901/CDDP细胞的抑制率达62%,并表现为吋间和剂量依赖性;琼脂糖凝胶电泳实验证明100gmol/L的OA处理SGC7901/CDDP细胞48h后基因组DNA被降解，可见较典型的DNA梯形带;蛋白质免疫印迹分析表明，100pmol/L的OA处理SGC7901/CDDP细胞48h后，细胞内凋亡相关的蛋白酶caspase3被激活。结论OA在体外能够诱导SGC7901/CDDP细胞凋亡，诱导凋亡的途径可能是

3、线粒体途径。【关键词】齐墩果酸;SGC7901/CDDP;细胞增殖;细胞凋亡胃癌H前手术治疗大部分是在进展期进行，而且单纯手术疗效甚差。作为综合治疗重要组成部分的化疗，已成为治疗胃癌的重要手段，较为有效的药物有5氟尿U密喘、顺钳(CDDP)、阿霉素〔1)等。凋亡通路的缺陷被认为是恶性肿瘤细胞并常增生和对化疗纱物抵抗的主要原因(2),因此诱导肿瘤细胞凋亡己经成为治疗肿瘤的一个有效途径。齐墩果酸(OlcanolicAcid,OA)是一种天然药物，广泛存在于植物屮，以游离或结合成昔的形式存在。近年來发现OA可以通过多种机制

4、抑制结肠癌细胞和肺癌细胞增殖(3〜5〕。木研究通过药物持续接触细胞培养的方法，逐步递增CDDP的浓度，体外诱导建立了人胃癌CDDP耐药细胞株SGC7901/CDDP,并进一步探讨OA对SGC7901/CDDP细胞增殖的抑制作用及作用机制，为胃癌的非手术治疗和天然药物的开发提供依据。1材料与方法1」材料SGC7901细胞椒屮国科学院上海细胞库);CDDP(冻干型，山东齐鲁制药厂);OA购自屮国药詁生物制詁检验检定所。OA用二甲亚IM(DMSO)溶解配制成80mmol/L的原液，・20°C储存;用含10%小牛血清RPMI

5、1640培养基稀释成不同浓度的工作液。羊抗人的半胱氨酶蛋白酶3(caspase3)抗体为Oncogene产品(Darmstadt);兔抗人肌动蛋白(actin)抗体、化学发光底物检测试剂盒购HSantaCruz;辣根过氧化物酶标记的抗兔及抗羊IgG购H屮国屮山生物技术公司;DNA纯化试剂盒购自Promega;RPMI1640和小牛血清购自Gibco。1.2方法1.2.1人胃癌SGC7901细胞的培养常规复苏人胃癌SGC7901细胞，按贴壁方法培养，培养基为RPMIMedium1640,每100ml含青霉素1万U,链霉

6、索100mg,胎牛血清15ml,用灭菌的5.6%NaHCO3溶液调pH值至7.2。置于CO2孵箱，37°05%CO2条件下培养，细胞生长至近融合状态时，用0.25%胰酶消化传代，每周1〜2次。1.2.2体外诱导法建立CDDP耐药的人胃癌细胞株SGC7901/CDDP对数牛长期的胃癌细胞株SGC7901用含CDDP100ng/ml的RPMI1640培养液培养2w后，将细胞消化传代，用正常RPMI1640培养液悬浮细胞，细胞再次贴壁后形态恢复，将CDDP%物浓度提高到200ng/ml,在此浓度下维持2w;方法同上依次将

7、药物浓度提高到300、400、500>1000ng/ml□在1000ng/ml药物浓度下维持培养，初步得到SGC7901/CDDP细胞株。1.2.3OA对SGC7901/CDDP细胞增殖的影响实验设对照组和OA处理组。OA处理组分别以终浓度为40、60、80和100gmol/L处理细胞，细胞培养液中DMSO的终浓度＜0.05%o以5x107细胞/L,接种于96孔培养板中,每组均设3个平行孔，分别培养12、24、48和72h。每孔加入3甲基四氢噬呼硫酮2(MTT)20卩1,孵箱内孵育4h后，每孔再加入DMSO200pl

8、,振荡10min后，用酶标仪在波长490nm处测定吸光度值，计算OA处理细胞的生存率(％)=(各实验组OD值/对照组OD值)x100%⑹，绘制细胞生长曲线。1.2.4DNA琼脂糖凝胶电泳每瓶接种1x106细胞，以100pnol/L的OA处理细胞12〜72h;同吋设空白对照组。收集细胞;加入500川浓度为7mol/L的盐酸弧溶解细胞，按照Prom