DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响.pdf

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1、第32卷第2期沈阳师范大学学报(自然科学版)Vo1．32No．22014年4月JournalofShenyangNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Apr．2014文章编号：1673—5862(2014)02—0273—04DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响王鹏飞1,2，蒋滢，徐俊锋，汪小福，陈笑芸，缪青梅。，李胡莹(1．沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳110034；2．浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021)摘要：国内外非常重视转基因产品的检测工作，主要依赖于DNA的PC

2、R方法进行检测，其检测结果可靠、稳定、灵敏度较高。尤其在转基因产品的定值实验中，荧光定量PCR的应用起到重要的作用，但是DNA的质量是保证荧光定量PCR定值准确的关键。实验以100的克螟稻为材料，用CTAB法、商品化的Promega、Qiagen以及TIANGEN提取试剂盒，分别提取克螟稻基因组DNA，经过核酸蛋白分析仪初步测定浓度、纯度以及离子浓度后，分别以水稻内源基因PLD和克螟稻特异性转化体引物及探针实施荧光定量PCR实验，以100克螟稻为盲样实施定值，来确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的DNA提取方法，最终确定Qiagen和TIA

3、NGEN提取试剂盒满足荧光定量PCR对100的克螟稻标准物质定值实验的要求。关键词：克螟稻；荧光定量PCR；提取方法中图分类号：Q943．2文献标志码：Adoi：10．3969／．issn．1673—5862．2014．02．0310引言在分子生物学实验中，植物基因组DNA的制备是开展进一步研究的基础，DNA质量的好坏决定了后续试验研究的成败l1]。目前提取植物基因组DNA方法很多，其中使用最为广泛方法有传统的CTAB法、SDS法、商品化的提取试剂盒Wizard法、DNAsecure法、DNeasy法。由于不同实验材料的组分差异，这些不同的方

4、法所提取的DNA质量也不尽相同，对后续的实验结果也存在差异[2-3]。所以很多专家学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法，或对现有的提取方法进行改良。曹文波[4]通过向原尿素法中的裂解液中添加tiME、用预冷的无水乙醇代替异丙醇沉淀核酸等研究出了改良型的尿素法。黄萱l_5]通过在研磨材料时加入液氮、用剪去端部的吸头转移含有DNA的溶液，并将加入RNaseA的步骤放在最后等改进了Clark利用CTAB提取植物基因组的方法。随着分子生物学研究的不断深人，DNA又作为分子生物学的基础，同时依据不同植物的特点，不同植物的最适合DNA提取方法也在不

5、断研究中，尤其是自转基因作物开始商业化种植以来，转基因作物得到了迅猛的发展，这就为转基因产品的检测与管理提出了新的挑战]。转基因产品阳性材料的制备对转基因产品的检测起到至关重要的作用，阳性材料的定值是否准确就对所提取DNA的质量提出了更高的要求。本实验通过比较CTAB法和3种国内外常用的植物基因组DNA提取试剂盒提取的DNA对荧光定量PCR定值带来的影响以确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的植物基因组DNA的提取方法，为转基因产品的定量检测和阳性标准品的制备提供可靠的实验依据。收稿日期：2013一l2一l8。基金项目：辽宁省教育厅高等学校科

6、学研究项目(L2O12387)。作者简介：王鹏飞(1987一)，男，辽宁朝阳人，沈阳师范大学硕士研究生；通信作者：李碉莹(1966～)，女，辽宁大连人，沈阳师范大学教授，博士，硕士研究生导师274沈阳师范大学学报(自然科学版)第32卷1材料与方法1．1材料1．1．1实验样品100的克螟稻为农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心(北京)提供。1．1．2主要试剂CTAB提取缓冲液、RNA酶A溶液、0．1×TE缓冲液(pH=8．0)、ABIPCRMasterMix(5mL)。基因组DNA提取试剂盒：1)WizardMagneticDNAP

7、urificationSystemforFood(Promega公司，美国)；2)DNeasyPlantMiniKit(Qiagen公司，中国)；3)DNAsecurePlantKit(TIANGEN公司，中国)。1．1．3主要仪器电子天平，微量高速离心机(BACKMAN公司)，电热恒稳水浴锅，生物安全(Thermo公司)，核酸蛋白定量分析仪(Ultrospec1100型，GE公司)，7500Real—TimePCRSystem(美国ABI公司)。1．2方法1．2．1DNA的提取分别用CTAB提取液和3种商品化试剂盒Promega、Tiang

8、en、Qiagen提取100克螟稻基因组DNA，提取方法分别参照各试剂盒中的操作手册进行。将提取纯化后的DNA溶于0．1×TE置于～20℃保存，每种提取实验重复3次