不同方式保存的蜘蛛基因组dna提取方法的探索

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1、万方数据蛛形学报ActaArachnologicaSinica，Nov．2009，18(2)：88．91ISSN1005—9628doi：10．3969／j．issn．1005—9628．2009．02．008不同方式保存的蜘蛛基因组DNA提取方法的探索卢晓亮唐贵明’张慧赵娜娜内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特010022摘要：基因组DNA的提取是在分子水平上进行研究的基础，提取的DNA的纯度、浓度及结构的完整性是进行基因工程各项研究的前提条件。本文用SDS法、CTAB法和饱和NaCI法等3种方法分别对75％乙醇浸泡、无水乙醇浸泡、一20"C冷冻

2、及新鲜蜘蛛标本基因组DNA进行提取，并进行比较。实验结果表明：使用SDS法提取一20"C冷冻保藏的蜘蛛标本基因组DNA，可以达到分子生物学研究的要求。关键词：蜘蛛；保存方式；基因组DNA；DNA提取分子生物学的飞速发展，使人们对生物体的认识已从形态结构深入到分子水平。通过分析不同物种DNA分子的结构异同来探讨物种的起源与进化，已成为现代生物学的研究热点之一。利用分子生物学技术从核酸水平对动物进行物种鉴别以及探讨物种的起源和进化，是现代生物系统学和生物进化学的研究热点之_二，这类研究的基础是获得物种的DNA。在使用分子生物学方法研究动物分类中的若干问题时，

3、如何用简单、省时的方法从动物体内获得高质量的DNA，是后续实验的前提。基因组DNA提取方法研究报道较多(田英芳等，1999；刘波等，1999；王智等，1999；印红等，2002；童丽娟等，2002；安瑞生等，2002)，但对不同保藏处理的标本基因组DNA提取研究不多(靳然等，2007)。本研究分别采用SDS法、CTAB法和饱和NaCI法等3种方法，提取了4种保存方式下的蜘蛛基因组DNA，并对实验结果进行了比较，找出3种方法及4种保存方式的优缺点，结果表明，在蜘蛛分子生物学研究中采用SDS法提取一20℃冷冻保存标本的效果最为理想。1材料4种保存方式的蜘蛛标

4、本：新鲜标本、冷冻标本、75％乙醇浸泡标本和无水乙醇浸泡标本。所有供试材料均为雌I生星豹蛛，乙醇浸泡标本于采集地直接进行处理，冷冻标本将活体带回实验室冷冻保存，为防止消化道内食物对DNA的污染，实验时均切去腹部进行操作。75％乙醇浸泡标本、无水乙醇浸泡标本、冷冻标本均于2008年5月1日采自呼和浩特市小井沟。新鲜标本为2009年5月2日采自呼和浩特市小井沟。2方法2．1标本的预处理乙醇浸泡标本用蒸馏水浸泡l昼夜，期间换水3次。冷冻标本与新鲜标本用75％乙醇消毒后蒸馏水冲洗，灭菌滤纸吸干后切去腹部备用。2．2基因组DNA提取2．2．1SDS法(田英芳，19

5、99)提取缓冲液：由A液、B液和蛋白酶K溶液以8：l：1的比例配制而成。A液：Tris0．05M；NaCl0．1M；Na2EDTA0．1M。调pH值为7．以7．8，灭菌后于4℃保存。B液：5％的SDS。蛋白酶K溶液：2mg／mL，一20℃保存。平衡酚。氯仿：异戊醇=24：1(体积比)。无水乙醇和70％乙醇，置于．20℃冰箱预冷。TE缓冲液：1MTris；0．2MNa2EDTA调pH值为8．0。将蜘蛛从浸泡液中取出，迅速用双蒸水清洗表面，用灭菌滤纸吸干，切除腹部后置于1．5mL离心管中，加入600肚L提取缓冲液，用灭菌钝头镊子研磨至溶液较清澈透明为止；38

6、℃温浴3h；在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒10次，10000rpm离心10min，取上清加入等体积的氯仿：异戊醇，上嗵讯作(Correspondingauthor)E-mail：tgm4392896@imnu．edu．cn收稿日期(Received)：2009．06．04内蒙古师范大学研究生科研创新基金(cⅪJs08003)项目资助项目万方数据Nov．，2009卢晓亮等：不同方式保存的蜘蛛基因组DNA提取方法的探索下缓慢颠倒10次，离心10rain；取上清加入2倍体积一20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA，置一20℃冰箱中2h以上；12000rpm

7、离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤DNA，离心5rain后缓慢倒去上清液，用灭菌小滤纸条擦干管壁后自然干燥；加50斗L1xTE(10mMTris，1mMEDTA，pH8．0)回溶，一20℃放置至少ld，即可用于琼脂糖凝胶电泳检测。2．2．2CTAB法(文菊华和颜享梅，2005)取出材料，蒸馏水冲洗，加入CTAB(Tris：100mM；Na2EDTA：20mM；NaCl：1．4M；pH8．O)研磨；涡旋30s；37℃水浴lh；加入3斗L蛋白酶K(2mg／mL)，20txL5％SDS，65℃水浴1h；加1倍体积氯仿：异戊醇(24：1)，水平摇床20rai

8、n，10000rpm离心10min；重复1遍；取上清加2倍体积的无水乙醇，1／1