人心脏发育候选基因hole的功能研究.pdf

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1、科技创新来--2005一瘸毒睾科技论坛人心脏发育候选基因hole的功能研究①周军媚朱传柄李永青王跃群吴秀山(湖南师范大学生命科学学院)摘甏MAPK信号抟警途径是存在于真孩细胞申蟪最产泛的一耪璃节规裁，宅与心焱管翡发学、心瓤肥大等心脓疾病的发生有着密切的关系。本文利用荧光索酶的活性分析讨论人b如基因农MAPK信号途径争蠹搴罅用。安验表明，COS一7细胞申过表达托如蛋鸯能够强烈抑制MAPK信号途强的两个下游转纛鹅手AP—l和SRE的转录活性。ho／e的突变体报道基因分析表明，ho／e基因可能楚通过箕N’端的ERK结合区和C’端的多聚脯氨酸序列采行使其抑

2、制作用的。本研究表明该基因可能通过参与MAPK信号途径而在心脏发育的过程中起作用。关键词心脏嫡；ho／e；mAPK信号途径心脏发育从中胚层细胞的分化、线性心管的形成到最终复杂四腔室心脏的形成，都受到多种信号途径严密蔫精确她调控。罄蓠我们对于心脏发育过程所涉及的调控蛋良与信号途径仍知之甚少，因此，发现新的参与心脏发育过程的信号途径调控蛋白具有重要的理论和应用意义。hole基因是我们在寻找与心脏发育相关的撼因时克隆的一个人的新基因¨j。Hole基因位于14号染色体，我们扶mRNA水平对该基因进行了Northernblot分析，结果显示hole基因在心脏

3、组织中的表达非常强烈。对Hole基因在心脏中的表达谱分析表明，它可能与心脏的发育有关。通过构建增强型绿色荧光蛋白与hole融合基因的真核表达系统，转染COS一7细胞系，瞬时表达后荧光显微镜观察了它编码蛋白的活细胞定位及表达，表明hole蛋自主要在细胞膜和细胞质中表达，而且在细胞质中点缀着大小不一的点状荧光。本论文利用报告基因分析测试hole对SRE和Ap一1转录活性，荧光素酶分析试验发现hole蛋白在COS一7细胞中过表达能强烈抑制MAPK信号途径的两个下游转录因子AP一1和SRE酶转录活性。hole突变俸的荧光素酶分析试验表噗，hole基因可煞通

4、过其N’端靛ERK结合区和C’端的多聚脯氨酸序列来行使其抑制作用。1材料与方法1．1质粒的构建用XhoI将禽有hole基因的pMDl8一T—hole质粒进行酶切，所得片段纯化后与经过XhoI①基众项目：国家自然科学基金项目(3021010392，30270722，30270644，30470867，30570934．30571048，30570265)：辩技部973羰曩《2005C13522505)；长江学豢翅颠溜默发爱计划资助(IRT0445)；潮辩省基金(04FJ2006)蕊Ot．n一，．c．，，kejichuangxinkaituoweilo

5、i．‘勰．；r_耘、‰．、*二、”，⋯，一?麓。。r酶切处理的pCMV—tas2B连接循环水浴过夜，转化大肠杆菌DH50t，转纯后提质粒，经酶切鉴定并测序，得到pASl[pCMV—ta92B—hole]。由于hole基因含有一个PstI酶切位点，位于hole基因酶1003姊处，鞠在ho／e蛋自的284氨辇酸楚，可戳将hole酶甥分成两段，鄹：N’端的ERK结合区(DD)和C’端的多聚脯氨酸序列(PP)。于是我们将pASI㈤刖一蚶¨眦。进行PstI酶切，分别纯纯酶切产物，所得小片段为瓣’壤的ERK结合区《DD)，大片段隽载俸与C’端的多浆精氨酸序列(

6、PP)。将小片段与经Pstl酶切后并去磷酸化的pCMV—ta92B载体连接，大片段纯化恁囊连，则得至嘻分别含氨基酸1—284和氮基酸284—319的hole蛋自的2个突变体：pAS2[pCMV—ta92B—DD]和pAs3[pCMV—ta92B—PP]重组质粒。l。2细胞培养与瞬时转染CoS一7细胞培养予含氮苄青霉素(100lu,g／mL)和链霉素(100p．g／mL)以及10％胎牛血清的DMEM(购自Gibco)培养基，维持单层贴壁生长，在细胞处于对数生长期时进行传代。细胞复苏、接种、传代、冻存均按常规操作进行。转染脂质体LipofeetAMIN

7、E，Opti—MEM(OMEM)购扇美国lnvitrogen公司。细胞转染方法按Invitrogen公闭的说明书进行。1．3荧光素酶涵毪捡溯按常规转染方法，将重组质粒pASl、带荧光素酶报告基因pSRE—LUC(orpAP—l—LUC)，laeZ(彝一半襞糖营酶)基因遴行共转染。LacZ力测转染效率臻。荧光素酶活性检测方法如下：经过两天培养后的转染细胞用PBS洗涤两次，然后用lx裂解液裂解细胞，室温静嚣，离心收集缨胞，取上清，加入ONPGassay，在37℃蠖湿培养籀反应30rain，点至溶液变黄；然后加入trisbase终止反应；再用分光光度计测

8、420nm的吸光值，计算其转染效率；根据转染效率计算德管与荧光素酶底物反应所需的蛋白量；最后将荧光豢酶底物和蛋白混匀，利用