心脏发育相关基因pax-8实验的研究

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1、温州医学院硕士学位论文心脏发育相关基因Pax．8的实验研究中文摘要目的：研究胚胎发育不同时间心脏特异性骨形态形成蛋白受体认03MPRlA，又名AL飚)基因敲除小鼠心肌组织中的Pax．8的mRNA表达水平，并构建含大鼠Pax．8基因全长序列的真核表达载体pcDNA3．1Pax．8，并将重组质粒转染至心肌细胞系H9C2细胞中进行表达，测定转染后Pax-8基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法：雌的Q—MHCCre+／一，ALK+／一和雄的ALK3F／F(在ALK3基因第二外显子两边插入LoxP的片段)交配，以胎膜及胎体PCR鉴定为ALK3基因敲除纯合子小鼠(Q—MHCere+／一、ALK3F／一)

2、胚胎心脏为实验组，对照组为相同胎龄C57／B6小鼠；时间点取胚胎9．5天(E9．5d)、E10．5d、E11．5d、E12．5d、E13．5d、E15．5d、E17．5d及出生后第一天(PO)，均提取胚胎心脏总RNA，荧光实时定量PCR法检测两组小鼠胚胎发育各阶段心脏Pax-8基因mRNA的表达水平。KpnI、NotI双酶切pCMVsport6Pax一8质粒获得大鼠Pax．8全长基因，通过基因重组技术将其插入到具有相同粘性末端的真核表达载体pcDNA3．1中，构建重组质粒pcDNA3．1Pax一8。质粒聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)、限制性酶切鉴定和D

3、NA测序鉴定插入片段确实为Pax8基因。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9C2细胞中，反转录聚合酶链反应(reversetranscript—polymerasechainreaction，RT—PCR)及Westernblot法分别检测转染后Pax-8信使RNA(messageRNA，mRNA)及蛋白表达水平，CCK8法检测转染后细胞增殖能力。以不含胎牛血清的DMEM培养基培养心肌细胞48h，造成血清饥饿诱导心肌细胞凋亡模型，同时进行Pax．8质粒及相同量空质粒转染，分组：①正常细胞组；②阴性对照组：转染相同量空质粒的正常细胞组；③转染重组Pax．8质粒的心肌细胞凋亡模型；④转染

4、相同量空质粒的心肌细胞凋亡模型。转染后48h，进行AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)染色。流式细胞仪进行检测，AnnexinV单阳性为早期凋亡细胞。提取以上各组细胞蛋白，Westernblot法检测细胞凋亡蛋白酶(Caspase3)的表达，评估细胞凋亡情况。结果：荧光实时定量PCR结果显示：C57胚胎小鼠9．5、10．5、11．5、12．5、13．5、15．5、17．5d的Pax．8基因的表达水平以10．5d表达最高，随后迅速下降至出生后表达最低；ALK3基因敲除纯合子胚胎小鼠心脏Pax．8基因的表达高峰则出现在胚胎发育的第12．5d，且较对照组的峰

5、值显著降低(P<0．05)，至胚胎第13．5天以后纯合子小鼠死亡。温州医学院硕士学位论文而通过酶切、重组的pcDNA3．1Pax-8真核表达载体转染心肌细胞后证实Pax．8基因mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0．05)及空质粒组(P<0．05)。转染Pax．8基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0．05)，ArmexinV-FITC／PI双染流式细胞仪检测凋亡率表明，Pax-8基因能明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P

6、高峰的右移、表达量下调，提示Pax．8基因在胚胎发育中不同时间的表达变化可能与小鼠心脏胚胎发育迟缓、室间隔形成有关。同时我们通过基因重组技术成功使得Pax-8基因在心肌细胞中过表达。并证实Pax．8可促进心肌细胞的增殖及保护心肌细胞的凋亡，故我们推测其抗凋亡功能可能是其参与胚胎心脏发育的机制之一。【关键词】骨形态形成蛋白受体IAPax．8真核表达细胞增殖细胞凋亡温州医学院硕士学位论文StudyofthePax-·8GeneRelatedtoHeartDevelopmentAbstractAIM2ToinvestigatethePax-8genemRNAexpressioninthecardi

7、ac-specificdeletionofbonemorphogeneticproteinreceptortypeIA(BMPR-IA，alsonamedALK3)miceduringdifferentdevelopmentperiodofthemiceembryo．AndthenconstructandexpresspcDNA3．1vectorofratPax-8fulllengthgeneinH9C2my