茶树花蕾发育相关基因的分离及表达研究

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1、安徽农业大学博士学位论文荟绀花营发育相关基因的分离及功能分析(2007)中文摘要茶树是我国重要的经济作物之一，在国民经济中占有重要地位。茶树是叶用作物，鲜叶的产量与经济产量密切相关。茶树从花芽形成到种子成熟，共经过约一年半左右的时间，从6月到12月的6个月时间中，一方面是当年的茶花进行孕蕾、开花和授粉，另一方面是上一年受精的茶花发育形成种子并成熟的过程，两年的花果同时发育生长，都是大量消耗养分的生理和生长活动过程。花果的生长和发育对茶树养分的供应要求较高，生殖生长往往会抑制营养生长，使新梢的生长势和育芽能力减弱，导致茶树鲜叶产量

2、减少和品质降低。如何控制茶树的生殖生长，促进营养生长是关系到茶树产量和品质提高的关键性问题。在茶叶生产上，茶树的繁殖多采用短穗扦插的无性生殖方式进行，有利于优良性状的稳定遗传。茶叶生产上不提倡用种子繁殖，主要是有性繁殖的后代出现性状分离现象，因而不能像其它作物那样利用基因型相同的杂种一代。但无性繁殖整个过程在技术、设备和材料方面要求较高，同时苗木的运输需特殊护理，与有性生殖比较其花工多、病虫害容易传播、抗逆性等也比实生苗弱，而这些方面种子繁殖具有很大的优势。茶树虽然是异花授粉植物，但白花结实率一般为2％左右，要想利用杂种第一代，

3、需要采取隔离等措施。利用雄性不育育种可以节约大量母本去雄的劳力，保证种子纯度，充分发挥杂种优势，同时可以解决育种中存在的茶树品种趋向单一化和遗传育种资源不足的问题。目前，从分子水平上探索与茶树品质有关的特征性代谢产物的研究进展较快，一些与茶树品质相关的功能性基因相继得以克隆和研究，但是对茶树生殖发育相关的分子生物学研究甚少。因此，茶树育性相关基因的表达研究，对阐明茶树结实力的分子机理有重要的理论意义，为将来利用生物技术控制茶树品种韵育性，在茶叶生产上利用杂种优势，提高茶叶的产量、品质和茶树的抗性奠定理论基础。为此本研究分别以茶树

4、结实率差异明显的品种龙井43、乌龙的发育早期和发育晚期的花蕾为材料，重点进行如下研究：一是关于花蕾早期和晚期发育基因存在的差异表达方面，利用cDNA-AFLP技术对早期和晚期花蕾的差异表达进行分析，二是对茶树花蕾的获得的TDF片段进行分析，寻找到与育性相关的基因进行全长克隆和分析。主要结果如下：1．对cDNA-AIoLP技术体系进行优化，结果表明：cDNA-AFLP预扩增比较适宜的退火温度为53"C，扩增循环次数为20个循环，预扩增和选择性扩增PCR体系中M矿+浓度为2．3mM．2．利用eDNA-AFLP技术，对茶树花蕾发育期的

5、基因表达进行了分析。结果表明，茶树花蕾在早期和晚期发育中的基因表达有明显差异。共显示1110条带，安徽农业大学博士学位论文茶树花蕾发育相关基因的分离及功能分析(2007)其中，晚期发育的花蕾显示的特异条带有87条；选取15个重复性好的并在两个品种晚期发育的茶树花蕾中均特异表达的片段在GenBank进行序列分析，结果显示，有9个分别与氧化还原酶、染色体13、14—3—3蛋白、Amyrel基因、钙网蛋白、ATP硫化酶、接触反应／铁离子结合蛋白、花粉特异蛋白和干燥相关蛋白的序列有相似性；2个与假拟蛋白相似，4个在GenBank数据库中

6、未找到相似序列。3．以E12和M22引物对茶树两个品种花蕾不同时期的表达差异进行分析，在两个品种的花蕾发育晚期同时发现一条特异表达条带TDF39。RT-PCR证明该基因只在茶树两个品种的晚期发育花蕾中特异表达。利用RACE技术获得该基因eDNA全长为1072bp，经BLAST查找比对，该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与杨树的14-3．3蛋白基因有88％和86％的相似性，同时，该基因与其它植物的14．3．3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。由此，推断该基因为编码茶树1年3．3蛋白的基因，其ORF由

7、783个核苷酸组成，编码260个氨基酸，5’非翻译区和3’非翻译区分别为67和222个核苷酸组成。将茶树14．3．3蛋白的eDNA克隆到原核表达载体PET-32a中，并在表达宿主菌E．CoilBL21trxB(DE3)中高效表达。结果表明，表达的融合蛋白分子量约49．4kDa，该融合蛋白包括112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及260个氨基酸残基的14．3．3蛋白。随着诱导时间的延长，表达的融合蛋白产量逐渐增加，表达蛋白总量在诱导3h最高达到菌体总蛋白的34．6％，随后，菌体总蛋白随时间的延长表达量呈下降趋势。采用制备SDS-PAG

8、E，提纯了在原核表达的14—3-3蛋白，以此为抗原对实验白鼠进行免疫注射。经We．stem-blotting检测获得的免疫血清产生了特异性抗体，并用Western-blotting的方法验证了茶树中的14．3．3蛋白只特异性地在茶树花蕾发育的晚期表达，而在茶树花