人类心脏发育候选基因lrrc10的功能研究

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1、湖南师范大学硕士学位论文人类心脏发育候选基因LRRC10的功能研究姓名：张才波申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：吴秀山;王跃群20060501摘要心脏病严重地威胁着人类的健康和生命，近几年，心脏病的死亡人数占到疾病死亡总人数的三分之～。为攻克这一顽症，首先必须从分子水平上系统地研究控制心脏发育的基因及其相互调控关系。小鼠LRRCIO基因在心脏组织具有大量而特异的表达，人类中也发现了LRRCIO基因，它与小鼠的上艘aD基因在蛋白质水平的相似性高达84％，它是一个很好的人类心脏发育候选基因。对人LRRCIO基因的深入研

2、究对于探讨心脏发育的基因调控机制，对于心脏病的诊断、治疗具有重大的理论和实践意义。为了研究￡艘CJD在心脏中的作用机制，本文从酵母双杂交方法入手，在成人心脏文库中筛选鉴定到6个与LRRCl0发生相互作用的蛋白质，其中FHL2是一个在心脏组织特异表达的基因。作者用免疫共沉淀和Pull．Down验证了LRRCl0与FHL2确实发生相互作用，并以二者的相互作用为重点做了进一步的研究。利用免疫荧光研究LRRC10和FHL2在COS．7细胞的定位情况发现，LRRCl0主要定位在细胞核，FHL2在细胞核质均有表达，当二者共同转入细胞时，

3、FI--IL2发生了趋核，二者都集中在细胞核表达。利用荧光报告基因分析初步发现LRRCl0具有转录抑制活性。LRRCl0．GAL4BD的过表达强烈抑制了GAL4DNA结合位点启动子控制下的荧光报告基因的表达。FHL2的共同表达减弱了LRRCl0的抑制作用。荧光报告基因分析发现LRRClO的过表达对AP．1途径下游基因的转录活性具有抑制作用，而FHL2作为AP．1的辅基和c．Jull结合，增加AP．1转录激活活性。二者共同转入COS．7细胞时发现这种拮抗关系。作者还通过免疫共沉淀试验发现，LRRCl0和c．Jun发生相互作用，

4、LRRCl0、FHL2、c．-Jun三者可能形成一个三元复合体行使功能。关键词：心脏发育；酵母双杂交；免疫共沉淀；激活蛋白质1．IIABSTRACTCardiovasculardiseaseshavebecomeoneofthemostseriousdiseasesthatthreatenhumanbeings．Itisacriticalprerequisitetounderstandthenormalprogressofcardiovasculardevelopmentandthemechanismsunderlyingt

5、hecausesofthiskindofdiseases．Inordertopromoteourunderstandingforcardiovasculardevelopmentanddiscoverythemolecularregulatorymechanismsduringthisprogress，hereweinvestigatedLRRCIOwhichhasbeenreportedtobeexpressedinheartandmuscleonly．Ayeasttwo——hybridwasperformedtoiden

6、tifyproteinsthatinteractwithLRRCIO．FromascreenusingaGAL4AD--fusedhumanheartcDNAlibraryandGAL4BD—fusedhumanLRRCIOasbait，weisolatedFHL2asoneofthepositiveclones．TheinteractionwasconfirmedusingaGSTPull—’DownassayinVit_r'O,andanimmunoprecipitation(IP)assay如vivaFHL2alone

7、distributesbothinthecytoplasmandnucleusbutwasredistributedtothenucleuswhenLRRCIOwascoexpressedinCOS一7cells．LuciferaseassayfoundthatLRRCIOinhibitthetranscriptionalactivateofAP—l，whileFHL2increasec-Jun—dependenttranscriptionbyactingasacoactivatorofAP一1．ResultsofIPsug

8、gestthatLRRCIO，FHL2andc—Junmayformaternarycomplex．UIConclusion，weidentifytheinteractionofFHL2withLRRCIOanddeterminedthatFHL2andLRRCIOmayformatern