人类心脏发育候选基因rmnd5armnd5b的克隆及其功能研究

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1、湖南师范大学硕士学位论文人类心脏发育候选基因RMND5A/RMND5B的克隆及其功能研究姓名：唐文岘申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：袁婺洲;吴秀山20060501摘要心脏是脊椎动物器官发生过程中最早形成的结构之一。它的发育过程机理复杂，受一系列基因的精确调控。目前心血管系统疾病已经成为威胁人类健康最大的两个敌人之一。鉴定在心脏发育过程中起调控作用的基因和分子途径，将促进人们从分子水平认识心脏发育和先天性心脏病发生的机制。MAPK信号传导途径是广泛存在于脊椎动物的一利-细胞调控机制，许多转录因子都是重要的MA

2、P信号途径的靶分子。为了鉴定控制心脏发育和疾病发生的新基因，本研究从心脏cDNA文库中克隆了两个人类新基I拳]RMND5A彻^弘，D馏。RMND5A基因位于2号染色体，长3239bp，编码391个氨基酸，其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA。RT-PCR结果表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达，在心脏、肝和肾中的表达水平较强。亚细胞定位实验结果表明RMND5A蛋白主要在细胞核中表达，少量在细胞质中表达。并且我们发现RMND5A蛋白在COS7等细胞中的过表达很有可能具备引发细胞凋亡的功能。RMND5B基

3、因位于5号染色体，长1825bp，编码393个氨基酸，结构域与RMND5A相同。人体早期胚胎的RT-PCR实验证明它在7月龄胚胎的心脏中有强烈表达。通过原核表达分别得到洲D5A和洲D5B的GST融合蛋白，并用兔血清免疫的方法得到了尺舢鲥和尺舢5B基因的多克隆抗体，这为从免疫组织化学方面研究它们的功能提供了便利。分别构建pCMV-ta92B与RMND5A和RMND5B的真核表达载体，转录活性分析在COS7细胞中过表达RMNDSA蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK．1番I：IAP．1的转录活性显著下降。在C

4、OS．7细胞中过表达RMND5B蛋白能抑制转录因子ELK．1的活性。综合H前的研究结果来看，尺舢鲥和尺^删D馏两个基因都可能通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程。关键词：心脏发育，RMND5A，RMND5B，MAPK，转录活性，RNA干扰ABSTRACTTheheartisoneofthefirstformedstructuresduringorganogenesisinvertebrate．Cardiogenesisisaverycomplexprocessanditrequiresprecisereg

5、ulationofseriesofgenes．Now,cardiovasculardiseaseshavebecomeoneofthetwomostseriousdiseasesthatthreatenhumanbeings(theotherarecancers)．Theidentificationofthemolecularpathwaysthatinvolveheartmorphogenesiswillprovideabasicunderstandingofhowheartisformedandofhowconge

6、nitalheartdiseases(CHD)aretakenplace．Mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)signaltransductionpathwaysarethemostwidespreadcellregulationmechanismsamongalleukaryoticorganisms，andmanytranscriptionfactorsareprobablyimportantMAPKsignaltargets．Withtheaimofidentifyingnov

7、elgenesinvolvedinhumanheartdevelopmentanddiseases，twonovelgenes，RMND5AandRM-ND5B，wereisolatedfromheartcDNAlibrary．RMND5Agenemapstochromosome2p，withacDNAlengthof3239bpwhichencodesapolypepeidecontaining391aminoacidswithaLisHdomain，aCTLHdomainandaCRAdomainfromN—toC

8、-terminal．ByRT-PCRwefoundthisgeneisexpressedinmostoftissuesofhumanembryos，especiallystronglyexpressedintheheart，liverandkidney．Observationunderthefluorescentmicroscop