大黄多糖对TNBS诱导结肠炎症鼠Th1和Th2细胞极化的影响.pdf

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1、大黄多糖对TNBS诱导结肠炎症鼠Th1和Th2细胞极化的影响刘莉梅其炳*王志鹏曹晓林张蓉李晨龙铟周四元第四军医大学药理教研室陕西西安710032国际自然科学基金资助项目No30100239摘要目的观察大黄多糖RheumtanguticumPolysaccharideRTP对TNBS诱导不同背景鼠性结肠炎症的影响研究RTP治疗结肠炎症的免疫作用机制探讨中药多糖产生免疫作用-1的信号途径方法采用TNBS/乙醇复制大鼠/小鼠结肠炎症模型以200mg·kgRTP灌胃5天进行治疗观察RTP对结肠炎症SD大鼠和BALA/

2、c小鼠死亡率结肠重量溃疡面积和+MPO活性的影响采用流式细胞术和免疫组化法观察RTP对结肠炎症鼠CD4T细胞扩增的+对抗作用以Elisa夹心法观察RTP对CD4T细胞亚型Th1和Th2所分泌的细胞因子IFN和IL-4的影响结果TNBS/乙醇复制的大鼠/小鼠结肠炎症模型显示出Th1和Th2细胞反应有所不同在SD大鼠产生的肠道炎症主要是以Th1反应IFN产物占优为主的免疫反应而TNBS诱导BALA/c小鼠产生的肠道炎症主要是以Th2反应IL-4产物占优为主的免疫反应RTP对这两种不同免疫状态的鼠性结肠炎症均具有良

3、好的治疗作用溃疡面积P<0.01++结肠重量P<0.01MPO活性P<0.01对血液CD4T细胞的扩增和结肠粘膜CD4T细胞的浸润均具有明显的对抗作用抑制SD大鼠结肠炎症时Th1细胞分泌的IFN的升高P<0.01也对抗BALA/c小鼠结肠炎症时Th2细胞分泌的IL-4的升高P<0.01结论RTP对于Th1细胞占优势的免疫状态和Th2细胞占优势的免疫状态均具有良好的调节作用提示中药多糖治疗自身免疫性疾病具有良好的前景0引言炎症性肠病inflammationboweldiseaseIBD包括溃疡性结肠炎ulcer

4、ativecolitisUC和克隆氏病CrohnsdiseaseCD以反复发作的肠道炎症为特点研究表明过度的Th1或Th2细胞活性介导其炎症反应主要与Th1分泌IL-12和INF或Th2分泌的IL-4和IL-10[1-2]相关TNBS诱导大鼠产生的肠道炎症主要是以Th1反应为主的免疫反应与人类的CD较为类似而TNBS诱导BALA/c小鼠产生的肠道炎症则是以Th2反应为主的免疫反应是研究[3-4]人类UC良好的动物模型我们以前的实验可见大黄多糖RheumtanguticumPolysaccharide[5]RT

5、P对TNBS诱导的大鼠肠道炎症具有良好的治疗效果其机制与抑制结肠炎症大鼠CD4[6]细胞的扩增expansion有关然而RTP影响CD4的机制尚不清楚为阐明RTP治疗结肠炎症的免疫机制探讨中药多糖产生免疫作用的信号途径本实验采用RTP观察对TNBS诱导不同背景鼠性结肠炎症的影响1材料和方法1.1实验动物二级BALA/c小鼠60只体重18-22gSprague-Dawley大鼠37只体重220-250g雌雄各半由本校实验动物中心提供动物饲养于空调室内室温222°C相对湿度50-60%自动调控昼夜各12h颗粒饲料

6、喂养自由饮水将动物随机分为3组每组10只包括正常-1对照组模型组TNBS/ethanol和RTPig,200mg·kg治疗组1.2实验试剂:大黄多糖RheumtanguticumPolysaccharideRTP经沸水回流乙醇沉淀浓1缩除蛋白脱色透析和冷冻干燥后通过Sephacryl-S400凝胶柱层析得到经硫酸-苯酚法测糖含量硫酸-咔唑法测糖醛酸含量糖含量(糖醛酸含量)为97.4%27.5%246三硝基苯磺酸2、4、6-trinetrophenesulphonicacidTNBS购于Sigma十六烷基三甲基

7、溴化胺和邻联二茴香胺购于FlukaCD4Mab购于ImmunotechCD4多抗为SantaCruze产品SABC免疫组化染色试剂盒DAB染色试剂盒购于博士得公司INF和IL-4试剂盒为CortexBiochem产品[7]1.3结肠炎症模型复制大鼠禁食24小时乙醚麻醉除生理盐水组外用30mgTNBS/40%乙醇灌肠复制大鼠实验性结肠炎症模型小鼠禁食24小时乙醚轻微麻醉除生理盐水组外用3mgTNBS/38%乙醇灌肠复制小鼠实验性结肠炎症模型造模6小时后灌胃ig-1给予生理盐水和RTP200mg·kg治疗1次/d

8、共5天记录体重和动物死亡率第六天乙醚麻醉下打开腹腔腹主动脉取血处死动物从肛门向上截取大鼠8cm/小鼠4cm结肠在冰浴中沿肠系膜缘剪开肠腔漂洗内容物用透明薄膜画出溃疡面积结肠称重后刮取结肠黏膜液氮速冻后转入-80保存待测MPO活性同时取脾脏胸腺称重1.4MPO活性的测定将结肠粘膜50mg在HTAB缓冲液中匀浆11000g离心15min取[8]100l上清液应用Krowisz法测定MPO活性+1.5免疫