人胎儿肝脏间充质干细胞的体外培养及生物学特性研究

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1、中国医药生物技术2010年8月第5卷第4期ChinMedBiotechnol，August2010，Vo1．'N．4·论著·DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673—713X．2010．04．008人胎儿肝脏问充质干细胞的体外培养及生物学特性研究毕薇薇，黄若洋，刘洋【摘要】1材料与方法目的建立一种在体外分离、培养人胎儿肝脏来源的间充质1．1材料干细胞(MSC)的方法，并研究其生物学特性。1．1．1标本来源人胎儿肝脏组织来源于四平市方法采用双酶消化法分离获取人胎儿肝脏MSC并进行中心医院药物流产胎儿，胎龄2～3个月，母亲身体

2、外培养，待细胞达80％以上融合时传代，各传代细胞依体健康(捐献者均签署知情同意书)。肝功能正常，次记为P1PIO代细胞，并于倒置相差显微镜下观察细胞肝炎病毒标志物均为阴性。梅毒阴性，HIV阴性。形态。取P3、P7、P10代细胞，连续培养7d，观察分析1．1．2主要试剂与仪器0【．MEM培养液和优等细胞生长曲线。取P5代细胞，采用流式细胞仪检测MSC胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；胰蛋白表面CD34、CD44、CD105、CD13、HLA—ABC、HLA-DR酶购自美国Gibco公司；II型胶原酶购自美国等抗原标志的表达。取P

3、4代细胞，进行体外成骨细胞诱导Sigma公司；FITC标记的小鼠抗人CD34、CD44、培养后，采用碱性磷酸酶染色鉴定。冻存传代细胞，分别于CD105、CD13、HLA—ABC、HLA—DR单抗购自法2、6个月后复苏细胞，台盼蓝染色计数复苏后细胞存活率。国Immuntech公司；细胞培养瓶购自美国Coming公司；371型高温灭菌CO2培养箱购自美国结果原代细胞3d贴壁，6d后开始快速增长并形成集Thermo公司；程序降温盒购自美国NALGENE公落，11d左右达80％～90％融合，多呈纤维样；传代培养司；CKX41型倒置相差显微镜为日本

4、Olympus公后细胞维持纤维样形态。传代细胞生长曲线具有共同特征：司产品。潜伏期约24～48h，对数增殖期约3～4d，对数增殖期后1．2方法第5～6天进入平台期。流式细胞仪检测显示，MSC表面1．2．1人胎儿肝脏MSC的分离与培养无菌取CD34、HLADR呈阴性表达，CD44、CD105、CD13呈阳出胎肝，用PBS冲洗数次，剪碎后用0．25％胰酶性表达，HLA—ABC呈弱阳性表达。碱性磷酸酶染色显示，消化后4℃过夜。次日取出于37℃继续消化5～诱导后细胞的细胞核染成均一的淡蓝色。冻存复苏后细胞存活率达90％以上，且与未冻存传代细胞相比

5、具有相同的生10min，吸出细胞悬液，在剩余组织中加入0．1％的长特性。II型胶原酶，37℃中和10rain，消化后组织用200目筛网过滤，获得的细胞悬液270×g离心结论本研究成功地从人胎儿肝脏培养出MSC，为MSC5min，细胞沉淀用PBS洗2次。将细胞沉淀置应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源。于含10％胎牛血清的u．MEM培养液中，吹打制【关键词】间质干细胞；肝；细胞，培养的备成终浓度为1×10。／ml的细胞悬液。将细胞悬液www：cmbp．net．on中国医药生物技术．2010．5(4)：277-280加入装有含10％胎牛

6、血清的0【一MEM培养液的25cm=z培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中近年来，对间充质干细胞(mesenchymalstem培养。48h后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养液；cell，MSC)的研究越来越细致和深入，MSC的动随后2—3d换液1次，倒置相差显微镜下观察细物及临床试验研究也越来越广泛。MSC可来源于胞生长情况并拍照。待细胞生长至10d左右达骨髓、脐带、脂肪、肌肉等组织，其中研究与应用80％以上融合后，加入0．25％胰蛋白酶．0．02％较多的是自体骨髓MSC。但由于骨髓来源的MSCEDTA(I：1)混合液消化进行重复传代

7、培养，受年龄及身体状况等因素影响，其细胞质量和数量受到很大限制I1J。为此，本实验尝试在体外从人胎作者单位：136000吉林省四平市，四平市中心医院中心实验室儿肝脏中提取MSC并研究其生物学特性，以期为通讯作者：毕薇薇，Email：biweiwei1974@163．corn将来MSC的临床应用奠定基础。收稿日期：2010—02．24中国医药生物技术2010年8月第5卷第4期ChinMedBiotechnol，August2010，Vo1．5，No．4各代细胞依次记为P1～P10代细胞。1．2．2MSC生长曲线的测定取生长良好的P3、P7、

8、P10代细胞，用0．25％胰酶(含1mmolEDTA)消化后，以2X104／~的密度接种于24孔板，每孔1ml。每天各取3孔消化计数细胞，取平均值，连续培养7d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴