北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性-论文.pdf

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1、第32卷第6期华中农业大学学报Vo1．32No．62013年11月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityNov．2013．99～105北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性牧仁边艳超浦亚斌李向臣王凤龙关伟军1．内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；2．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193摘要从713龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞，原代培养并传代至15代，免疫荧光法检测造血祖细胞／肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达；RT-PCR检测CD29、CD44

2、、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响，选取最佳培养方案，同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞，结果表明，从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类问充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能，其所具有多向分化的潜能，为今后临床广泛应用提供了可能。关键词北京油鸡；间充质干细胞；生长曲线；诱导分化中图分类号S831文献标识码A文章编号1000—2421(2013)06—0099—07间充质干细胞(mesenchymalstemcells，1材料与方法MSC

3、s)是来源于早期中胚层的一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，存在于机体各个组1．1材料织内，具有贴壁能力，体外能够大量扩增和免疫原性北京油鸡入孵7日龄胚胎由中国农业科学院北低的特点，其在特定条件下可向成骨细胞、脂肪细京畜牧兽医研究所昌平实验基地种禽场提供。胞、软骨细胞和肌细胞等细胞类型分化，是一种较为1．2主要试剂理想的细胞治疗应用的种子细胞。MEM、DF-12、FBS购自美国GIBCO公司，胰北京油鸡是中国特有的肉蛋兼用型优良家禽品蛋白酶、地塞米松、胰岛素、IBMX、5一氮胞苷、DMS0种，曾为清代宫廷御用鸡种，距今已有3

4、00余年历购自美国Sigma公司，bFGF购自英国Peprotech史，其肉质细腻、肉味鲜美、蛋质优良、生活力强、遗公司，CK19(兔抗鸡，l：100)、CD34(兔抗鸡，1：传性稳定，适合北京地区散养。21世纪初北京油鸡100)购自日本MBL公司，MHC(鼠抗鸡，1：100)已处于畜禽遗传资源受威胁等级目录中仅高于濒临抗体购自美国DSHB公司，FITC标记的羊抗兔二灭绝等级的濒危资源等级[1]，已被列入国家级畜禽抗、FITC标记的羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥遗传资源保护名录E23，同时北京油鸡是国内37个受(2F-0311、2F-

5、0312)，RT_PCR试剂盒购自TaKaRa到严重威胁的畜禽遗传资源品种之一。笔者应用现(DR0O1A)公司，RT-PCRMarker均为北京天根生阶段主流细胞生物学研究方法，对中国特有家禽品产Marker工(MD101)，引物合成由上海生工生物工种北京油鸡胎肝MSCs生物学特性进行研究，以期程有限公司进行。达到丰富畜禽MSCs研究的物种范畴，揭示北京油1．3鸡胎肝MSCs分离培养鸡胎肝MSCs适合的培养条件、保存及分化过程中无菌环境中取人孵7日龄鸡胚置于装有PBS的一些特性的目的，并为今后的深入研究提供一些溶液的平皿中，眼科手术

6、器械分离鸡胚肝脏，同时剔借鉴。除肝脏韧带，PBS漂洗胚胎肝脏3遍，挤压排尽胚胎收稿日期：2013—03—15基金项目：转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08009—003—006，2011ZX08012—002—06)、基本科研业务项目(2012z1072)和国家家养动物种质资源平台项目(2012)牧仁，博士研究生．研究方向：畜禽干细胞及动物传染病与分子病理学．E-mail：mmarstina@126．corn通讯作者：关伟军，教授．研究方向：畜禽干细胞及遗传资源保护．E-mail：喇guan86@iascaas．net

7、．cn王凤龙，教授．研究方向：动物传染病与分子病理学．E-mail：wangfengloo@sohu．com1OO华中农业大学学报第32卷肝脏内血液，冲洗后的胚胎肝脏放置于干燥空平皿1．6鸡I1~／1]：MSCs鉴定中，用眼科剪将胚肝剪碎为约1．0mm。大小组织取入孵7日龄北京油鸡胚胎肝脏冷冻切片，包块，加入2mL0．125／oI(质量分数)胰蛋白酶溶液埋剂进行包埋，切片后使用经多聚赖氨酸包被的载(美国Sigma公司)，37℃消化20min后加入5mL玻片贴片备用，北京油鸡P3代肝脏MSCs经爬片含1OFBSMEM培养基终止消化，轻

8、轻吹打消化后再与胚肝组织切片一起固定、通透、封闭处理，之的组织块，使细胞从组织中充分分离，经75fm细后加入1BSA稀释的一抗CK19(兔抗鸡，1：胞筛滤过，除去未消化组织块，1000r／min离心100)、CD34(兔抗鸡，1：10