体外培养脐血间充质干细胞生物学特性及影响因素.doc

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1、体外培养脐血间充质干细胞生物学特性及影响因素脐血间充质干细胞是一类从脐带血中分离和培养的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化的潜能。脐血间充质干细胞的这些特性，吸引了众多国内外学者的目光，目前，脐血间充质干细胞移植的临床治疗取得了一定进展。本文就脐血间充质干细胞的采集分离、纯化及生物学特性及研究前景作一简要综述。脐带血是指胎儿娩出，脐带结扎，残留在脐带和胎盘靠lull近胎儿段内的血液。脐带血中含有两种干细胞：造血干细胞(Hematopoieticstemcells,HSCs)和间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)。脐带血造血干细胞异体移植后发生

2、免疫排斥反应的可能性极低［1］,它已应用于临床治疗，主要用于治疗造血系统疾病(白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤)、糖尿病、肝脏疾病等。间充质干细胞具有高度的自我更新和多向分化的潜能，这些特性近年来引起了国内外众多研究者的广泛关注。Lee等［2］将冷藏0.1〜5年的脐血单个核细胞培养3〜5周，获得贴壁的细胞呈现成纤维细胞样形态，并具有间充质细胞的免疫表型，表明可以长期冻存保存脐血间充质干细胞。2000年，Erices［3］首次报道脐血中含有间充质干细胞，其形态和免疫学表型和骨髓间充质干细胞相似。Karen[4]认为脐血间充质干细胞分离成功的关键在于：①从脐血中采集分离时间不超过15h

3、；②脐血的量不少于33ml；③单个核细胞量不少于1X108个。但脐血间充质干细胞分离成功率低[5-6],甚至有些学者认为脐血中没有间充质干细胞[7-9]o且随着胎龄的增加，脐血间充质干细胞的数量、生长活性及分离培养的成功率逐渐下降。1影响脐血间充质干细胞分离培养成功的因素1.1脐血的采集量：个体差异较大，与产妇分娩的方式、采集者操作水平等因素有关，脐血采集量越大、分离的成功率越高。1.2采集到分离的时间：要求24h内完成分离接种，时间越短分离培养的成功率越高。1.3分离方法及培养条件的优化：目前脐血间充质干细胞的分离，完全套用骨髓间充质干细胞的分离方法，这可能是导致脐血间充质

4、干细胞分离成功率低的重要原因之一。国内外众多学者对脐血间充质干细胞培养条件进行优化，但由于条件的限制，尚无统一的评价标准，难以进行比较。1.4首次接种密度：接种密度过大，细胞接触抑制，生存空间不足，培养基中的营养成分消耗过快；密度过低无法形成细胞生长所需的环境或者原代细胞发生老化。1.5血清浓度：文献报道血清浓度10%〜20%,—般认为低浓度血清更利于脐血间充质干细胞生长，高浓度的血清含有大量促进细胞增殖的因子，细胞增殖迅速，容易过早发生老化。胎牛血清中异种蛋白随脐血间充质干细胞移植入人体后会增加细胞毒性反应或者免疫排斥反应的风险。国内有报道，通过从脐血中分离自体血清成功培养

5、出脐血间充质干细胞，可以大大降低免疫反应；但自体血清量少，则难以支持脐血间充质干细胞长期大量扩增。1.6细胞因子的使用：可以向纯化后的脐血间充质干细胞中添加bFGF、EGF、GM-CSF、IL-3等细胞因子［10］。1.7pH值：偏酸性的环境抑制造血干细胞及破骨样细胞的生长，有利于脐血间充质干细胞的纯化。2脐血间充质干细胞的分离方法2.1密度梯度离心法：为提高单个核细胞分离的成功率,目前多采用自然沉降与密度梯度离心相结合的方法。加速红细胞沉降，可以向脐血中加入大分子物质，女口：明胶［12］、務乙基淀粉、甲基纤维素等，也可以通过红细胞裂解液氯化铁去除红细胞。干细胞的密度与单个核

6、细胞密度基本相同，在高速离心条件下通过分层液Ficoll或Percoll将单个核细胞从脐血中分离出来。该方法操作简单，获得的MSCs量可以满足体外培养所需细胞密度要求。2.2贴壁培养法：体外培养的脐血间充质干细胞有贴壁生长的特性，但该方法提取的细胞纯度不足，可有大量红细胞、巨噬细胞、破骨样细胞等细胞成分。多次传代后仍可见杂质细胞，对间充质干细胞增殖有一定影响。目前多主张将密度梯度离心与贴壁培养方法相结合，可获得较理想的分离效果。2.3免疫磁珠分选：表面包被抗体的磁珠与表面标志抗原特异性结合，通过正选或负选将脐血间充质干细胞分离出来。该方法对细胞活性影响较大。2.4流式细胞仪分

7、选：将干细胞大小和表面标记进行分离，获得的细胞纯度高。免疫磁珠和流式细胞仪分选的方法,对脐血量要求大、抗体价格昂贵，对脐血间充质干细胞的活性影响较大，不适合实验室推广。2.5单细胞克隆方法：该方法技术要求较高，难以获得大量的脐血间充质干细胞。3脐血间充质干细胞的培养脐血间充质干细胞适合在偏酸性的环境中生长，目前常用的培养基有DMEM/F12.LG-DMEM.a-MEM、IMDM培养基。一般认为间充质干细胞专用MesencultTM培养基培养功率较高，但该培养基价格昂贵限制其广泛地使用。如：Both等［1