液相色谱-串联质谱法同时检测DNA中3-甲基腺嘌呤和3-乙基腺嘌呤.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第8期2014年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1200～120410．11895／j．issn．0253-3820．140173液相色谱-串联质谱法同时检测DNA中3一甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤田永峰侯宏卫张小涛刘勇王安胡清源(国家烟草质量监督检验中心，郑州450001)。(中国科学院安徽光学精密机械研究所，合肥230001)摘要利用阳离子交换固相萃取柱(WatersOasisMCX)富集净化DNA样品，建立了液相色谱串联质谱(LC—MS／MS)同时检测DNA中3一甲基腺嘌呤(N3一M

2、eA)和3一乙基腺嘌呤(N3一EtA)的方法。采用氘代一3．甲基腺嘌呤(d3一N3一MeA)和氘代一3一乙基腺嘌呤(d5．N3．EtA)为内标；进样量3，分析时间为13rain；亲水相互作用色谱柱(WatersXBridgeHILIC)进行液相分离，流动相为10mmol／L甲酸铵一乙腈溶液(5：95，V／V，pH=4．0)，流速250~L／min；质谱条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：5500V，雾化气：369Pa，气帘气：185Pa，电离温度：400℃，驻留时间：40mS。本方法对N3一MeA和N3一EtA的检出限分别为0．043和0．007g／L，方

3、法回收率为87．8％～103．0％。采用本方法检测了卷烟烟气粒相物暴露的DNA中N3一MeA和N3．EtA含量。结果表明，卷烟烟气粒相物暴露后的小牛胸腺DNA中3一甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤可被本方法定量检出。关键词3-甲基腺嘌呤；3-乙基腺嘌呤；液相色谱串联质谱；DNA1引言卷烟烟气中包含超过5000种化学物质_l-2J，其中包含致突变并可导致DNA发生烷基化损伤的物质j。这些物质可与DNA反应形成烷化类的DNA加合物，已经成为多学科的研究热点I4。娴气中致癌性的烷化试剂与DNA反应的主要位点是鸟嘌呤的N7位和腺嘌呤的N3位，DNA反应后形成7一烷化鸟嘌呤和3一烷化腺嘌呤J。

4、3一烷化腺嘌呤中比较重要的是3一甲基腺嘌呤(N3一methyladenine，N3一MeA)lo]、和3一乙基腺嘌呤(N3一ethyladenine，N3．EtA)，其结构式见图1。3．甲基腺嘌呤在3-烷化腺嘌呤中突变性最强，并且具有基因毒性，3．乙基腺嘌呤虽然不具有基因毒性，但是在经体内烷基糖基酶的修复后会在DNA中产生脱嘌呤的位点，这些位点被认为是引起基因突变并导致癌症的主要因素¨。因此，DNA中的3．甲基腺嘌呤，3乙基腺嘌呤被认为是卷烟烟气接触后DNA发生烷基化损伤的标志物，。准确测定DNA中3．甲基腺嘌呤和3．乙基腺嘌呤，可用于评估DNA受到的破坏程度及可能的致癌风险¨

5、。目前，DNA中3烷化腺嘌呤的检测方法有气相NN色谱质谱法(GC．MS)E83，该方法前处理比较繁琐，需＼>要化学衍生化，并且灵敏度低和专一性不强；酶联免疫法(ELISA)解决了3烷化腺嘌呤检测中的专一性问题，但是操作过程繁琐，结果稳定性较差。液相3一甲基腺嘌呤3．乙基腺嘌呤色谱串联质谱技术因其具有灵敏度高、选择性好、操N3．MeAN3．EtA作简便、分析结果稳定可靠的特点，成为DNA加合图13-甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤结构式物研究中的理想方法。Hu等首次报导了一种Fig．1StructuresofN3一methyladenine(N3一MeA)and在线固相萃取结合液相色谱

6、串联质谱同时分析DNAN3一ethyladenine(N3一EtA)中7．甲基鸟嘌呤、3一甲基腺嘌呤和Ob_甲基鸟嘌呤的方法]，该方法检测7一甲基鸟嘌呤、3甲基腺嘌呤和O6_甲基鸟嘌呤的运行时间为12rain。目前，同时检20144)2-25收稿；20146o}接受本文系国家自然科学基金资助项目(Nos．21277174，21347002)E—mail：wangan@aiofm．ae．en；huqy1965@163．eom第8期田永峰等：液相色谱一串联质谱法同时检测DNA中3一甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤测DNA中3．甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤的液相色谱串联质谱方法还未见报道。本

7、实验建立了一种同时测定DNA中3一甲基腺嘌呤、3．乙基腺嘌呤的液相色谱串联质谱方法。本方法灵敏度高，稳定性好。利用本方法研究了卷烟烟气粒相物暴露后，DNA中3一甲基腺嘌呤和3一乙基腺嘌呤的含量。本方法可用于临床上评估烷基化试剂暴露后DNA的损伤程度。2实验部分2．1仪器、试剂与材料1200快速液相色谱仪(美国安捷伦公司)配备G1367D自动进样器、G1312B二元溶剂泵、G1316B柱温箱；API5500三重四级杆串联质谱仪(美国加州应用生物系统公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；数据采集与