液相色谱-串联质谱法测定生物样本全基因组DNA甲基化.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2012年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry120l～1206液相色谱一串联质谱法测定生物样本全基因组DNA甲基化彭思远张洁田美平王展林申河清(中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室，厦门361021)摘要建立了基于液相色谱一电喷雾串联质谱的分析方法，对生物样本中全基因组DNA甲基化水平进行定量测定。首先将DNA从生物样本中提取出来，将DNA片段酶解为单核苷，利用液相色谱一串联质谱测定胞嘧啶核苷和5一甲基胞嘧啶核苷的含量，从而计算出其全基因组DNA甲基化率。利用该法研

2、究了暴露于全氟辛烷磺酸的L-02细胞、1O例原发性肝癌病例血浆样本和lO例对照血浆样本的全基因组DNA甲基化水平，得出了它们的总甲基化率变化的初步结果。本方法操作简单，具有很高的灵敏度和稳定性，为研究生物样本，尤其是临床上易得但DNA含量极低的血浆样本的总甲基化水平提供了思路。关键词DNA甲基化；液相色谱；质谱；血浆；细胞；全氟辛烷磺酸引言生物基因组的表观遗传信息在基因表达的调控中具有重要作用，它可以随着外界环境因素的变化而改变，与环境暴露有密切关系。通过表观基因组(Epigenome)的变化，可以更深人地理解环境污染物对生物的负面影响。DNA甲基化是最常见的一种表观遗传

3、学修饰，在DNA甲基转移酶的催化作用下，胞嘧啶转化为5一甲基胞嘧啶。全基因组DNA的低甲基化被认为会导致染色体不稳定和基因突变高发。表观遗传修饰可以影响罹患疾病的风险。而DNA甲基化的变化是正常细胞转化为病变细胞的过程中最早发生的变化之一，在作为可导致不良健康效应的环境毒物暴露的生物标志物方面很有潜力。与此同时，癌细胞的全基因组通常呈低甲基化状】。各类研究还证实了环境化学物质的暴露会引起包括DNA甲基化改变在内的表观遗传修饰。目前，研究表明，异常的DNA甲基化状态作为一种表观遗传机制和持久性有机污染物暴露造成的疾病之间具有紧密联系，人群血液中的某些持久性有机污染物的水平和

4、全基因组DNA甲基化水平存在明显的负相关关系]。焦磷酸测序法(Pyrosequencing)是近年来研究全基因组DNA甲基化水平的最常用的方法。利用该方法测定在人类基因组中大量存在且DNA甲基化高发的重复元件Alu和LINE一1(Longinterspreadnucleotideelement)的甲基化率，以它们的甲基化水平代表人类基因组DNA甲基化的总体水平]。但是该方法得到的不是严格意义上的全基因组DNA甲基化率，并不能精确反映全基因组DNA甲基化水平的实际情况。SssI甲基转移酶法和免疫化学法也有部分应用，但是它们的检测灵敏度较低且结果不够精确。高效液相色谱法(HP

5、LC)能够准确定量测定基因组整体的DNA甲基化水平，并可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况。但是受紫外检测器本身灵敏度的限制，该法对于DNA含量较低的生物样品的分析不够理想。本研究组最近采用串联质谱作为检测器，测定了3种细胞系以及人类精子样本的全基因组DNA甲基化率0l。本研究在以前的基础上改进了液相色谱一串联质谱法，使用酶将DNA水解为单核苷，快速高效，易于操作，使用的四级杆线性离子阱质谱具有很高的灵敏度和精密度，能检测到极微量的目标核苷，不仅适用于大批量样品的DNA甲基化率检测，而且能够对含痕量DNA的生物样本，如血浆进行全基因组

6、DNA甲基化率的精确测定。2011—1卜O7收稿；2012-03—05接受本文系中国科学院知识创新工程重要方向项目(No．KZCX2EW-QN408)、“百人计划”项目和厦门市科技项目(No．3502Z20112017)资助E—mail：jzhang@iue．accn分析化学第40卷2实验部分2．1仪器与试剂LC一20AD液相色谱(日本岛津公司)，3200QTRAP串联质谱(美国ABI公司)；凝胶成像系统(美国Bio—RAD公司)。生物安全柜(海尔公司)；倒置显微镜(上海长方光学仪器)；CO：培养箱(日本SANYO公司)；恒温水浴锅(上海梅香仪器)；离心机(德国Hetti

7、ch公司)；含L一谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM高糖型培养基，胎牛血清，青霉素链霉素溶液(10000units／mL青霉素，10000mg／L链霉素)，胰蛋白酶一EDTA消化液(南京凯基生物科技发展有限公司)；杜氏磷酸盐缓冲液(DulbeccoSphosphatebufferedsaline，DPBS)，全氟辛烷磺酸(Perfluorooctanesulfonate，PFOS，纯度98％，日本东京化学工业有限公司)；DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；RNaseA(天根生化(北京)科技有限公司)；DNaseI(RNase—