气相色谱-质谱法测定大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸含量.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl187—1192DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150203气相色谱-质谱法测定大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸含量王菁田盛兰孙伟红林洪李振兴¨(中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛266003)(中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071)摘要建立了大菱鲆肌肉中羧甲基赖氨酸(CML)的气相色谱-质谱(GC—MS)检测方法。以大菱鲆为研

2、究对象，选用三氯甲丙酮对样品进行脱脂，经硼氢化钠还原、蛋白水解、净化、衍生化(酯化与酰化)后，进行GC—MS选择离子监测(SIM)模式检测。选取m／z392为定量离子，m／z392，365，333，305为定性离子。结果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面积与浓度在1～200g／L范围内呈良好线性关系，方法检出限为1ms／kg，定量限为5ms／kg，3个加标水平(10，150和350ms／kg)下的平均回收率在100％一104％之间，相对标准偏差RSD<5％(n=5)。关键词羧甲基赖氨酸；大菱鲆；气相色

3、谱．质谱；衍生化1引言晚期糖基化终末产物(Advancedglycationendproducts，AGEs)是食品中蛋白、脂质和核酸等组分在热加工过程中发生非酶糖基化反应的产物⋯，其中羧甲基赖氨酸(N一carboxymethyl—lysine，CML)为主要标志性产物J。研究表明，食品中AGEs与心脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病及其并发症等慢性疾病有密切关系’4J。为更好地监测其在食品中含量，建立灵敏可靠的检测方法非常必要。目前，关于食品中CML检测方法有酶联免疫法(ELISA)'5j、高效液相色谱法(

4、HPLC)J、液相色谱．质谱联用法(LC．MS)’m等。ELISA法操作相对简便，但假阳性率高，仅能得到CML相对值(kU／g)；HPLC法通过衍生化使CML具有荧光性并定量分析，但该具有荧光特性的衍生物不稳定，导致结果偏差较大；LC—MS具有良好的灵敏度，又避免了衍生化处理，但基质干扰带来的离子抑制效应难以避免，且检测成本昂贵¨。GC—MS具有高灵敏度、高选择性的优势，有望开发成有效的CML检测方法。Am61ie[等运用GC—MS对食品中CML进行检测，由于前处理、基质差异等原因，虽成功检测到奶粉等产

5、品中的CML，但未检测到鲑鱼中的CML。目前，尚未见水产品中CML确证检测方法的报道。本研究以海水鱼中重要养殖品种大菱鲆为研究对象，利用GC．MS测定鱼肉中CML含量，定量限由150g／L_l降到5g／L，为水产品中CML检测提供了技术参考。2实验方法2．1仪器、试剂与材料6890N／5973I气相色质谱联用仪(美国Agilent公司)，单四极杆，配有EI源。羧甲基赖氨酸(CML，纯度98％，加拿大TRC公司)；二氯甲烷(色谱纯，美国ACS公司)；三氟乙酸酐(色谱纯，纯度99％，北京百灵威科技有限公司)

6、；氯化亚砜(色谱纯，纯度999．5％，天津科密欧试剂公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；其它试剂均为国产分析纯。大菱鲆购自青岛南山水产市场，经“三去”处理后，取背部肌肉绞碎，分装后，置于一18~C保存备用。2．2溶液配制准确称取10．00mgCML于10．00mL超纯水，混匀，制成1mg／mL标准贮备溶液，分装后，于一18~C保存备用。配制6moL／LHC1、0．2mol／L硼酸盐缓冲液(pH9．2)、2mol／LNaBH4(溶于0．1moL／LNaOH)；取2015-05-07收稿；2015-

7、06．18接受本文系现代农业产业技术体系建设专项资金资助(No．CARS-50)E—mail：lizhenxing@OUC．edu．cal188分析化学第43卷1．46mL氯化亚砜缓慢加入100mL甲醇中，制成衍生剂备用。2．3样品前处理2．3．1脱脂准确称取200．0mg样品于50mL离心管，加人2OmL脱脂液，混匀，于4~C以4000r／min离心15min，弃上清液；再加入20mL脱脂液，重复上述离心操作，弃上清液后以氮气吹干，得蛋白沉淀。本研究选取正己烷]、水．甲醇．三氯甲烷[1引、三氯甲烷一丙

8、酮3种脱脂液进行比较。2．3．2硼氢化钠还原为避免样品中羰基化合物等经后续高温蛋白水解进一步生成CML造成检测结果偏大，向蛋白沉淀中添加2mL硼酸盐缓冲液和400NaBH溶液，混匀，于4~C反应8h。2．3．3蛋白水解将还原后的蛋白沉淀转移至10mL安瓿瓶中，加入8mL6mol／LHC1，充人氮气后封瓶，于1IO~C烘箱水解，得到蛋白水解液。2．3．4样品净化取50L蛋白水解液于1．5mL离心管，烘干后加入1mL超纯水复溶，混匀后过0．22