原生质体融合技术进行纤维素酶新菌株的选育及发酵研究.pdf

《原生质体融合技术进行纤维素酶新菌株的选育及发酵研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、StudiesonthebreedingofnewcellulaseStrainbyprotoplastfusionandtheFermentationProcessLiMiaoAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofScience1nFermentationEngineeringlnCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHun

2、an410004，P．R．CHINASupervisorProfessorZENGBai—quanMay,20t4中南林业科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：李训饵¨彳日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论

3、文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密6ij。(请您在以上相应方框打“√”)作者虢夺船导师躲L撇Ⅻ眵年F月邓日阳flp年f月节日摘要纤维素酶(cellulase)n--I"降解纤维素为糖类被人类利用，故被广泛应用于工业生产。目前国内外对纤维素酶的研究主要以木霉属、青霉属、曲霉属的真菌为主。青霉属(Penicillium)真菌可分

4、泌较为全面的聚糖酶系，而且酶系中p．葡萄糖苷酶的量比木霉纤维素酶分泌的更多，但是青霉属真菌对酸碱及温度的适应性不强，所产纤维素酶的活力不高。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)具有耐热、耐酸碱、耐旱、抗紫外线和耐有机溶剂等强抗逆性。选用产纤维素酶的青霉Q5和具有抗逆性的枯草芽胞杆菌K3为亲本，利用原生质体融合技术，获得既能够分泌高产纤维素酶又具有强抗逆性的融合菌株，其研究结果如下：通过对菌体生长浓度测定、显微镜观察计数和再生率计算等方法，对双亲原生质体的形成与再生进行优化。结果表明：亲本菌株青霉Q5酶解前，在其菌丝培养液中加入质量浓度0．5％的甘氨酸和质量浓度10

5、％的蔗糖，能够促使菌丝体较好的分散，利于酶解；在溶茵酶和蜗牛酶共同作用下进行酶解，质量浓度均为10mg／ml：35℃处理3h；原生质体生成量达到最大值，为6．85×106cfu／mL；亲本菌株枯草芽胞杆菌K3酶解前，用4U／mL的青霉素处理，在1mg／mL的溶菌酶作用下，35℃处理lh，原生质体量达到最大值，为1．46×107cfu／mL。利用高温和紫外照射的处理方式对原生质体灭活，通过原生质体的再生率确定双亲原生质体的灭活条件。结果表明，在65。C的水浴处理下，青霉菌Q5最佳热灭活的时间为2h，枯草芽胞杆菌K3最佳热灭活的时间是2．5h：在距30W紫外灯20cm处照射下，Q

6、5最佳紫外灭活时间为15min；K3最佳紫外灭活时间为25min。采用聚乙二醇(PEG)法和高Ca2+高pH法相结合诱导原生质体融合，通过正交分析，得到融合的最佳条件是融合温度为38℃，融合时间10min，PEG浓度为40％，在该条件下的融合率为3．08×10一。依据再生培养基上出现的菌落的形态和颜色，以及在刚果红培养基上呈现的透明圈大小进行分离，获得了5株融合子，分别是R8，R17，R35，R62，R158菌株。通过形态特征观察、生理生化分析、遗传稳定性及抗逆性研究，筛选获得了性状优良(酶活较高且抗逆性较强)的融合子R62，该融合子在pH8时保留pH6时酶活的74．01％，

7、在pH10时保留了其在pH6的最适条件下酶活的57．35％。经过高温60℃加热处理15min后，R62所产酶活较室温处理的青霉酶活提高了37．66％，较60℃处理后的青霉酶活提高了6倍。利用融合菌株R62为出发菌株，对其发酵培养基和摇瓶发酵条件进行优化研究，通过单因素试验、响应面试验确定最适产酶培养基配方为：淀粉2．99％、药媒3．02％、微晶纤维素4．04％、硫酸铵1．5％；最适产酶条件为转速220r／min、温度30℃、pH为5．5、发酵时问108h，得到纤维素酶活为189．39U／fmL，相较于未