多功能原生质体融合菌株的构建

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1、多功能原生质体融合菌株的构建作者：湖南农业大学来源：湖南农业大学时间：2009-01-07项目负责人：谭周进完成单位：湖南农业大学项目来源及编号：省教育厅青年项目（05B029） 成果简介：一、研究背景   微生物广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各个领域。迄今其应用多采用纯培养方式,即一种菌单独培养以获取有用物质。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段,纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面,能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究,从而丰富了我们对微生物形态结构,生理和遗传特性的认识。但是,在长期的实验和生

2、产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成，在自然界更为常见的是多种微生物混合培养。随着微生物应用技术的广泛开展，微生物培养技术也显得越来越重要。   在活菌制剂的应用方面，人们希望一种产品能够行使多种功能，解决多方面的问题，许多产品都是由多种微生物组成。目前，这类产品的生产形式上，一般采用将单一菌种分开培养，然后将多种菌的培养物混合在一起，组成多菌种多功能产品。这种生产方式，要求每种菌使用一次发酵罐，要求生产设备投资较大，能耗较高，大大提高了生产成本。现代发酵技术已

3、建立了多菌种混合发酵技术，但该技术生产过程也较复杂，难以保证产品中各菌种的数量协调。应用微生物育种技术中的微生物原生质体融合技术，设法将不同功能的菌种通过原生质体融合技术构建多功能单一菌种，能够达到单一菌种多功能的效果，对于降低多功能微生物产品的生产成本,增加效率,在实际应用中很有意义。   二、研究方法与步骤   1．菌体培养     斜面上挑取少量KR和B13菌种，分别接种至含50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 ml三角瓶中，37 ℃，150 r/min活化12 h；取1 mL活化后的培养液接种至新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，KR在

4、37 ℃，150 r/min条件下培养16 h，B13在37 ℃，150 r/min条件下培养12 h。   2．两菌株生长曲线的测定   分别将活化12 h的两菌株牛肉膏蛋白胨发酵液1 mL移至100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，摇匀，取12支无菌大试管，每支加入5 mL，37 ℃，150 r/min培养，两小时取样一次，测定A600 nm下的吸光度。   3．酶解前计数     分别将两菌种发酵液3000 r/min离心5 min，除去杂质，取上清，摇匀，取1 mL用装有9 mL无菌水的大试管依次稀释到合适浓度，各吸0.1 mL分别涂

5、布于牛肉膏蛋白胨固体平板，37 ℃培养24 h，计数为A。   4．原生质体制备   将离心后除去杂质的KR上清液与pH 8.0，1.2 mol/L蔗糖的高渗溶液按1：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为8 mg/mL，37 ℃，150 r/min酶解80 min；将离心后除去杂质的B13上清液与pH 7.0，0.6 mol/L NaCl的高渗溶液按1：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为6 mg/mL ，37 ℃，150 r/min酶解45 min。期间用血球计数板在光学显微镜下观察原生质体形成情况，隔20或15 分钟取样一次，用

6、无菌水稀释成合适浓度后涂布牛肉膏蛋白胨固体平板计数B。原生质体得率即为：（A-B）/A%   5．酶浓度对原生质体制备的影响   分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL，按上述方法制备KR的原生质体，平板计数法计算原生质体得率。分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL，按上述方法制备B13的原生质体，平板计数法计算原生质体得率。   6．酶解时间对原生质体制备的影响    按上述方法制备KR和B13的原生质体。KR分别酶解20 m

7、in、40 min、60 min、80 min及100 min，平板计数法计算KR原生质体得率； B13分别酶解15 min、30 min、45 min、60 min，平板计数法计算B13原生质体得率。   7．菌龄对原生质体制备的影响   分别取在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养12 h、16 h和20 h的KR和B13菌体制备原生质体，按上述方法。平板计数法计算KR和B13原生质体得率。   8．稳定剂对原生质体制备的影响   分别将离心后的KR和B13发酵液与含0.8 mol/L，1.2 mol/L，1.6 mol/L的NaCl，蔗糖，葡

8、萄糖，D-果糖的磷酸缓冲液1：1混合，按上述方法制备KR和B13的原生质体，平板计数法计算KR和B13原生质体得率。   9． pH值对原生质体制备的影响    分别用pH值为5