NK细胞杀伤活性检测-2013-7-5兼.ppt

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1、NK细胞杀伤活性检测--乳酸脱氢酶释放法石河子大学医学院免疫学教研室2013-7-5目的要求熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。【原理】乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)变成还原型辅酶Ⅰ(NADH2)。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm

2、或570nm波长处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。实验原理效应细胞靶细胞释放LDH丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸盐硝基氯化四氮唑蓝【试剂】1.靶细胞检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562。2.效应细胞从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核细胞。3.1640培养液4.LDH底物溶液（临用前配制）NBT硝基氯化四氮唑蓝4mgNAD+I氧化型辅酶I10mgPMS吩嗪二甲酯硫酸盐1mg【试剂】加蒸馏水2

3、ml溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/LpH7.4PBS至10ml。5.1%NP—40：取1mlNP-40加去离子水99ml。6.1mol/L柠檬酸终止液取柠檬酸21g加去离子水100ml实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读取培养24~48hr的靶细胞(K562),洗涤3次（1000rpm×10min）,最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml,备用。靶细胞的制备：效应细胞的制备（分离外

4、周血单个核细胞）采集静脉血4ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血离心2000rpm×20min密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完全RPMI-1640，混匀，1x107）将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次2000rpm×10min用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层）计数PBMC1.计数4个

5、大方格中（即64个小方格）所有细胞数2.计数原则：数上不数下，数左不数右。3.总数除以4，所得数据×104即为1ml液体中的细胞总数4.每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞计数PBMC举例数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85总数为：87+79+91+85=342一个大方格的平均数为：342/4=85.51ml液体中细胞量为：85.5×104如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。效-靶细胞作用将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中,每份标

6、本设2个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1mlRPMI-1640液)最大释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液),1000r/min,2min后,置37℃、5％CO2温箱中孵育2-4h。A123456789101112实验组自然释放组最大释放组123456效应细胞（100μl）++----靶细胞（100μl）++++++RPMI1640（100μl）--++--1%NP-40（100μl）----++【操作方法】酶促反应：从37℃温箱中取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另

7、一培养板孔中。酶促反应置37℃预温10min,加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,37℃避光反应10～15min。终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30μl）A123456789101112结果计算用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值,并计算NK细胞活性。实验组OD值-自然释放对照组OD值NK细胞活性（%）最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值=×100%`1、无论采用何种试验方法,靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率<10％。2、分离PB

8、MC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细胞。4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。注意事项:实验报告记录NK细胞杀伤实验的原理、方法、结果。T淋巴细胞检查1．T细胞检查（1）T细胞花环形成试验（Erythrocyterosetteformationtest,ERFT）E花环形