NK活性测定.ppt

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1、淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定的体外试验淋巴细胞增殖试验3H-TdR、MTT、形态学计数细胞毒试验－－NK51Cr、LDH释放法、细胞凋亡检测法分泌功能检测细胞因子分泌细胞的检测（ELISPOT）抗体形成细胞的检测（溶血空斑试验）T细胞功能检测T细胞亚群的检测IL-2活性的测定淋巴细胞转化实验B细胞功能检测抗体形成细胞检测（溶血空斑试验）EA花环试验（测定Fc受体）SmIg的测定（直接免疫荧光法）NK细胞活性检测（细胞毒试验）吞噬细胞功能检测NK活性测定何谓NK？—NK概述NK活性测定实验原理实验材料及试剂实验步骤及结果判

2、读属淋巴细胞；无特异性TCR；无须致敏即直接杀伤靶细胞。表面标记CD3-、CD56+、CD16+表面受体（1）杀伤细胞活化受体（KAR）结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。（2）杀伤细胞抑制受体（KIR）识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号。主要生物学功能抗感染与抗肿瘤；免疫调节自然杀伤细胞NK细胞不杀伤正常细胞NK细胞杀伤靶细胞NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞NK细胞杀伤靶细胞电镜图胞核125I释放法荧光染料释放法NK细胞+靶细胞靶细胞溶解、破裂释放胞浆内酶类LDH释放法胞浆内蛋白51Cr释

3、放法实验原理效应细胞靶细胞释放LDH丙酮酸乳酸乳酸脱氢酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBTFormazan（OD570nm）实验材料1、LDH底物溶液（临用前配制）2、1%NP-403、1mol/L柠檬酸终止液NBT（硝基氯化四氮唑蓝）4mgNAD+（氧化型辅酶I）10mgPMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）1mg混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml加入2mlddH2O溶解加入0.1mol/LpH7.4的PBS至10ml实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读

4、取培养24~48hr的靶细胞(K562),洗涤3次（1000rpm×10min）,最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml,备用。靶细胞的制备：效应细胞的制备（外周血单个核细胞分离）采集静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血离心2000rpm×20min密度梯度离心分离外周血单核细胞用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完全RPMI-1640，混匀）将所得PBMC用5

5、倍体积的1640洗涤一次2000rpm×5min将毛细吸管直接伸到灰白色层（在血浆和分层液间），轻轻地吸取该层细胞（即为PBMC）效-靶细胞作用将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中,每份标本设2个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1mlRPMI-1640液)最大释放对照组(0.1ml靶细胞+0.1ml1％NP-40液),1000r/min,2min后,置37℃、5％CO2温箱中孵育2-4h。A123456789101112实验组自然释放组最大释放组123456效

6、应细胞（100μl）++----靶细胞（100μl）++++++RPMI1640（100μl）--++--1%NP-40（100μl）----++酶促反应置37℃预温10min,加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,37℃避光反应10～15min。终止酶促反应（用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30μl）A123456789101112结果计算用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值,并计算NK细胞活性。实验组OD值-自然释放对照组OD值NK细胞活性（%）最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值=×100%1、无论采用何种

7、试验方法,靶细胞的质量是影响细胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因素。一般要求靶细胞的自然释放率<10％。2、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白层，切勿搅动各层。3、吸取细胞培养上清时,应尽可能不吸动沉淀的细胞。4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。注意事项:Inaflowcytometerthecellsexitaflowcellandareilluminatedwithalaserbeam.Theamountoflaserlightthatisscatteredoffthecellsastheyp

8、assesthroughthelasercanbemeasured,whichgivesinformationconcerningthesizeofthecells.Inaddition,thelasercanexcitethefluorochromeonthecellsandtheflu