酶活性的测定ppt课件.ppt

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1、过氧化物酶(ＰＯＤ)活性的测定—愈创木酚法一、实验原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物。实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。在此酶存在下，H2O2将愈创木酚氧化生成茶褐色产物。此产物在470nm有最大光吸收，故可通过470nm处的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。二、材料和设备１、材料：马铃薯块茎２、仪器设备：751型分光光度计、离心机、研钵、25ml容量瓶、量筒、试管、吸量管。３、试剂：0.05ml/L愈创木酚溶液，0.05ml/L的磷酸缓冲液(pH5.5)，2%H2O2，　0.1mol/L儿茶酚溶液，20%三氯乙

2、酸溶液三、实验步骤１、酶液的制备取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g水中离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取２次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。２、过氧化物酶活性的测定酶活性测定的反应体系包括:2.9ml0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml2%H2O2、1.0ml0.05mol/L愈创木酚和0.1ml酶液。以在沸水中加热5min的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保

3、温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0ml20%三氯乙酸终止反应。然后，过滤(或5000g离心10min),滤液适当稀释，用751型分光光度计在470nm波长下测定反应体系的吸光度。四、实验结果以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位酶活力=——×D酶的比活力=——×D式中，△A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数△A0.01t△A0.01WtCAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶(HydrogenPeroxidase)又名触

4、酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为240000。存在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体内积累，从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一.过氧化氢酶的应用：被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。近年来，过氧化氢酶开

5、始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳）和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的重要指标。过氧化氢酶的测定：化学测定法：高锰酸钾滴定法，碘量法。光度法：紫外分光光度法，荧光分析法，化学发光法。电化学法：极谱氧电极法，电流测定法，电泳一染色法。放射化学测定法。简易气量测定法。高锰酸钾滴定法：过氧化氢酶（C

6、AT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：酶活(mgH2O2/gFW·min)=式中A—对照KMnO4滴定毫升数；B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；VT—酶液总量（ml）；V1—反应所用酶液量（m

7、l）;W—样品鲜重（g）；1.7—1ml0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mgH2O2。紫外分光光度法:H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中A240=AS0－AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；

8、0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。方法比较：研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器，适