t、b淋巴细胞增殖能力测定、nk细胞活性测定及t淋巴细胞亚群测定的方法

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1、T、B淋巴细胞增殖能力测定、NK细胞活性测定及T淋巴细胞亚群测定的方法一、T、B淋巴细胞增殖能力测定无菌条件下取大鼠的脾脏，加适量Hank’s液研磨，以200目不锈钢网滤过，1500r/m离心5分钟，弃上清，加Hank’s液重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI1640培养液混悬，以0.4%台盼兰拒染法计数，活细胞数不小于95%，加RPMI1640完全培养液稀释，并调整细胞浓度至1×107个/mL。于96孔微量板中，每孔加100mL脾细胞悬液（1×107cell/mL）和等体积的ConA溶液（终浓度为5μg/mL）、

2、LPS溶液（终浓度为10μg/mL）或RPMI1640培养液，重复3孔。另设空白对照组。37℃、5%CO2培养44h后，各孔加入50μLMTT溶液（2mg/mL），继续培养4h。1000r/min离心5分钟，弃去各孔上清，分别加150μL酸性DMSO溶液，振荡，于室温暗处放置15min，以酶标仪于波长578nm处测定OD值，并按下式计算刺激指数（SI）：SI（刺激指数）=加有丝分裂原培养物的OD值/不加有丝分裂原培养物的OD值。二、NK细胞活性测定实验前24h将靶细胞YAC-1传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用

3、RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×105个/mL。无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水裂解红细胞，20s后再加入0.5mL2倍Hanks液及8mLHanks液，离心10min（1000r/min），用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，调整细胞浓度为1×107个/mL。将靶细胞加入96孔培养板，每孔100μL，试验孔加入100μL脾细胞（效靶比50：1），自然释放孔加入1

4、00μL培养液，最大释放孔加入100μL2%NP40，37℃培养4h，离心，取上清100μL置96孔酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应8min，以30μL1mol/L的HCl终止反应，在酶标仪492nm处测定OD值。NK细胞活性（%）=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100%三、T淋巴细胞亚群测定取血加抗体，大鼠眼眶取血1mL，用EDTAk3血常规管抗凝全血，试管标号；取50μL抗凝全血，分别加入试管①、试管②，直接加至底部，且不可触壁；试管①统一加5μL抗体CD3+和5μL

5、抗体CD4+，试管②统一加5μL抗体CD3+和5μL抗体CD8+，用振荡器混匀后暗室放置20-30min，使抗体与血样充分结合；避光常温30min后，加裂解液：试管在振荡中加入500μL裂解液，在30℃水浴中放置15min，使细胞充分裂解，达到透亮；裂解后，1500rpm离心5min，倒去上液，用PBS液洗两遍，加1mLPBS液，1500rpm离心5min，后倒去上液；再加1mLPBS液，1500rpm离心5min；离心后倒去上液；加500μLPBS液，再用EPICSALTRA流式细胞仪检测。