系统实验之二T淋巴细胞功能测定

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1、系统实验之二T淋巴细胞功能测定付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn实验流程1W1.双向免疫扩散试验③2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④OVA(1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500µlOVA+CFA加强免疫小鼠500µl①摘眼球取血无菌取脾和胸腺②分离血清②2W取脾和胸腺②淋巴细胞转化试验②生理盐水（500µl)免疫小鼠腹腔内注射生理盐水加强免疫小鼠500µl①2WAfter1W对照组实验组抗体效价增殖功能实验内容小鼠摘眼球取血、分离血清淋巴细胞转化试验教学要求掌握

2、小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作淋巴细胞转化试验(Lymphocytetransformationtest)原理检测方法操作步骤应用实验分组及材料器材酒精棉球若干无菌纱布块1块/组无菌平皿1块/组无菌吸头（大、中、小）4盒/room无菌96孔培养板1块/组可调微量加样器4套/room细胞计数板1套/组显微镜1台/组EP管若干眼科剪、小镊子4套/room细胞培养箱（37℃5%CO2)酶标仪离心机2个/room超净台2个/room动物及试剂小鼠2只/组(NS,OVA)培养液（

3、IMDM)无FCS100ml/room培养液（IMDM)20%FCS30ml/roomConA（2.5,5,10µg/ml)各1.5ml/tube白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/roomMTT（5mg/ml)1.5ml/room二甲亚砜（DMSO)5ml/组分组：每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏免疫血清分离过程摘眼球取血RTfor2hrsRotation3000rpmfor20minTransferserumtoanewEPDoublediffusionStoreat4℃ELISA

4、1.5mlEP实验步骤单细胞悬液的制备：小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2mlIMDM培养液的平皿内。将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5mlEP管中。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1.5ml，设需要的细胞悬液体

5、积为Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。细胞计数板查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数(50)4细胞培养：按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%C02培养箱中，培养48小时。MTT掺入：（隔一天下午2:00）在终止培养前2

6、小时，在显微镜下观察细胞转化情况。每孔内加入MTT（5mg/ml)10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。在37℃5%C02培养箱中继续培养2小时，然后离心2000rpm，5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。加入100µl二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。（隔一天下午4:00）结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值：A570nm（用空白孔调零），记录结果。结果判定：SI（刺激指数）=ConA刺激孔A值/对照孔A值预习内容单克隆抗体的制备（理论P70，实验P106）双

7、向免疫扩散（理论P241，实验P116）八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺每孔加入100µl调好的细胞悬液1-3孔加入10%FCS-IMDM培养液，100µl4-6孔加入2.5µg/ml的ConA,100µl7-9孔加入5µg/ml的ConA,100µl10-12孔加入10µg/ml的ConA,100µlNOTE:ConA用10%FCS-IMDM培养液配制1-34-67-910-12Aspleencell+10%IMDMspleencell+ConA2.5µg/mlspleencell+Co

8、nA5µg/mlspleenCell+ConA10µg/mlBspleencell+10%IMDMspleencell+ConA2.5µg/mlspleencell+ConA5µg/mlspleenCell+ConA10µg/mlCthymuscell+10%IMDMthymuscell+ConA2.5µg/mlthymuscell+ConA5µg/mlthymusCell+ConA10µg/mlDthymuscell+10%IMDMthymuscell+ConA2.5µg/mlthymusce