nk细胞对乳腺癌细胞株体外杀伤作用

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1、NK细胞对乳腺癌细胞株体外杀伤作用摘要目的：探寻经免疫磁珠分选纯化的原代NK细胞体外长期培养、大量增殖的条件；研究HLA半相合的异基因NK细胞对实体瘤乳腺癌细胞株的体外杀伤作用，以及NK细胞表面的NKG2D受体及其相对应的、表达于肿瘤细胞表面的MIC配体的表达水平与该肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性之间的关系。方法：1，取健康成年人外周血lOml，Ficoll法分离获取单个核细胞，培养于6孔板，贴壁法去除单核细胞。使用德国美天旎公司MACS系统，CD56+Microbeads免疫磁珠分选试剂盒提取高纯度NK细胞。2．将EB病毒株B95—8细胞常规培养14天

2、，分别于第7天和第14天收集培养上清。将PBMCs与此含有病毒的上清共培养，并加入环孢索A(CyA)，至三者的终浓度为：PBMCs为1X106／ml，EB病毒为20％，CyA为20¨g／ml，培养于96孔板，根据细胞生长情况每3-4天换液一次，4周后收获EB病毒转化的B淋巴母细胞样细胞(EBV—LCLs)，作为NK长期培养的饲养细胞。以经照射EBV—LCLs作为饲细胞，在含有IL一15(100u／mL)和中浓度分别为lOOu／mL和500u／mLIL～2的SCGM(stemcellgrowthmedium)q1长期培养NK细胞。3．取瘤细胞或者NK细胞

3、约105个，碱裂解法抽提DNA，SSP—PCR方法检测肿瘤细胞HLA—Cw位点和NK细胞KIR位点表达，根据检测结果，分别将二者分为Gl组和G2组(G1组的HLA～C位点为HLA—Cw2、4、5、6，KIR位点为2DL2／2DL3和2DS2／2DS3)G2组的HLA—C位点为HLA—Cwl、3、7、8，KIR位点为KIR2DLl／2DSl)。4．MTT法检测HLA—Cw相合与不相合组的NK细胞对实体瘤细胞的杀伤率，以对NK细胞敏感的红白血病细胞株K562作为对照组。5．RT—PCR方法检测NK细胞表达NKG2D水平，了解其在与肿瘤细胞共培养前后表达水平

4、的变化，以及乳腺癌细胞表达MICA水平与NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤率的关系。结果：1．MAC$系统分选出的NK细胞，经流式细胞仪检测，CD3‘CD56+细胞的比例(91，1±7．4)％。使用EBV～LCLs作为饲养细胞，在含1L一2的干细胞培养液(SCGM)中培养NK细胞，比较了培养2周、3周、4周的NK细胞，其杀伤活力与新鲜分离的NK细胞相比并无显著下降；不同浓度IL一2对NK细胞增殖d的影响并无显著的统计学意义。2．KIR／HLA—Cw相合组的NK细胞对乳腺癌细胞株的杀伤率明显高于KIR／HLA—Cw不相合组，两组比较差异具有显著性(p<0．05)

5、。乳腺癌细胞表面MICA的表达水平较高的时候，则NK细胞对其的杀伤率也较高。结论：1．使用饲养细胞EBV—LCLs培养原代NK细胞，可进行体外长期培养，细胞活力不下降。2．NK细胞的KIR位点与实体瘤细胞的HLA-Cw位点相合组，NK细胞对瘤细胞的杀伤率明显高于HLA不相合组。3．肿瘤细胞表面表达的MIC分子水平和它对NK细胞的敏感性有关，肿瘤细胞表面的MICA分子可上调NK细胞表面NKG2D的表达，激发NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应。关键词：肿瘤免疫乳腺癌NK细胞KIRNKG2MIC过继免疫实体瘤生物治疗原代培养体外增殖扩增Effectsofnatu

6、ralkillercellsonkillingbreastcancercelllinesinvitroAbstractObjectiveToinvestigatethemostoptimalconditionsofculturingandproliferationofNKcellspurifiedfromPBMCsbynegativedepletionusingimmumomagneticmicrobeads；andtOinvestigatetherelationsbetweenKIRonNKcellsandHLA-Cwonthetumorcells，

7、whetherbreastcancercelllineswouldhaveenhancedsusceptibilitytoallogeneticKIR—incompatibleNKcellscomparedwiththeirKIR·-matchedallo--geneticcounterpartstoinvestigatetherelationsbetweenNKG2onNKcellsandMIContumorcellswiththekillingactivityofNKcells．Toanalysetherelationshipbetweenthee

8、xpressionlevelofMIContumorcellsurfacesandthespe