表柔比星序贯nk细胞体外杀伤乳腺癌细胞的研究

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1、表柔比星序贯NK细胞体外杀伤乳腺癌细胞的研究TheeffectofepirubicinsequentialNKcellsagainstbreastcancercellsinvitro作者姓名：董营专业名称：内科学指导教师：宋艳秋教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年6月3日前言含蒽环类药物化疗方案是临床上乳腺癌治疗公认的一线化疗方案。蒽环类药物自上世纪70、80年代开始应用于乳腺癌的辅助化疗，表柔比星是第一代蒽环药物阿霉素的立体异构体，虽然在乳腺癌治疗占重要地位，但仍不能完全清除肿瘤微小残余病灶，易产生耐药性，且毒副反应较重，很多患者无法耐受，大大限制了临床应用和临床疗效，这是乳腺

2、癌治疗面临的一个大难题，是蒽环类药物治疗乳腺癌关注的焦点，如何攻克蒽环类药物存在的负面问题在乳腺癌治疗研究中具有非常重要的临床意义。自然杀伤细胞（naturekillercells，NK）是人体先天免疫的重要组成部分，主要来源于骨髓，分布于血液和淋巴器官中，占外周血淋巴细胞10%~20%，发挥杀伤作用不需要预先致敏，不依赖补体和抗体，也不受主要组织相容性合物（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）的限制，能直接杀伤肿瘤细胞，在人体初期抗肿瘤和免疫监视中发挥重要作用。由于NK细胞人体内来源较少且抗癌活性低，从而限制了在临床肿瘤治疗中的广泛应用。目前已有多项

3、临床研究报道了NK细胞在肿瘤治疗中获得的疗效，其安全性和抗肿瘤作用已得到充分的肯定。前期研究我们针对HER-2阳性的乳腺癌细胞，给予赫赛汀处理后NKG2D活化性配体增加，联合NK细胞后其杀伤作用显著提高，而化疗作为疗效确切的抗肿瘤方法己广泛应用于临床，对于不应用赫赛汀的众多化疗患者，化疗药物处理后能否令乳腺癌细胞表面NKG2D活化性配体增高呢？关于化疗联合NK细胞治疗的研究报道较少，什么时机给予NK细胞疗法更有益于提高抗肿瘤疗效，有待于进一步的探讨。本实验利用体外诱导扩增培养乳腺癌患者的NK细胞，利用细胞生物学、分子生物学等实验技能，探究在EPI的影响下，NK细胞本身是否受到细胞毒性影

4、响，EPI序贯NK细胞对不同乳腺癌细胞系是否有协同作用并其作用机制进行探索，以期为下一步临床肿瘤治疗化疗结合免疫治疗的时机选择和抗肿瘤疗效的提供理论依据。I中文摘要表柔比星序贯NK细胞体外杀伤乳腺癌细胞的研究目的：探讨乳腺癌细胞应用表柔比星（Epirubicin，EPI）前后NK细胞对其杀伤活性的变化，并对其机制进行初步探索。方法：选用ER、PR、HER-2表达情况不同的三种乳腺癌细胞系，即ER+、PR+、HER-2–乳腺癌细胞系MCF-7，ER–、PR–、HER-2+++乳腺癌细胞系SKBR-3和ER–、PR–、HER-2–乳腺癌细胞系MDA-MB-231。应用MTT法检测不同浓度的

5、EPI作用于乳腺癌细胞和NK细胞的增殖抑制作用；应用钙黄绿素-AM释放法检测EPI（5.0µg/ml）序贯NK细胞对乳腺癌细胞杀伤的变化；应用流式细胞术检测EPI作用前后乳腺癌细胞表面NKG2D活化性配体(ULBP1、ULBP2和MICA)表达情况的变化；EPI序贯NK细胞作用于乳腺癌细胞时，ELISA法检测NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α的变化，流式细胞术检测NK细胞胞内穿孔素、颗粒酶B表达变化情况。结果：EPI对乳腺癌细胞和NK细胞的增殖均呈现显著抑制作用，并随药物剂量增加和作用时间延长抑制率增加；NK细胞在体外对乳腺癌细胞亦存在杀伤作用，并随效靶比的增加杀伤率增加。选取5.0μ

6、g/mlEPI预处理12小时后，NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤作用明显高于EPI未处理组及单独给药组，EPI序贯NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤具有协同效应；经过EPI处理后，乳腺癌细胞表面NKG2D活化性配体（ULBP1、ULBP2、MICA）表达均显著增高，NKG2D配体增高可增强NK细胞的杀伤作用。EPI序贯NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α增多，进一步增强NK细胞的杀伤作用。EPI序贯NK细胞胞内穿孔素和颗粒酶B的表达水平降低，需进一步进行研究。II结论：1、EPI序贯NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤具有协同作用。2.其协同作用机制可能与以下两方面相关：(1)乳腺癌细胞表面NKG2D活化性配体

7、表达上调；(2)NK分泌IFN-γ、TNF-α增多。3、EPI序贯NK细胞治疗方法适用于大多数类型的乳腺癌细胞。关键词:乳腺癌，表柔比星，NK细胞，免疫治疗，协同作用IIIAbstractTheeffectofepirubicinsequentialNKcellsagainstbreastcancercellsinvitroPurpose:TostudytheroleofEpirubicin(EPI)oncytotoxicityofNKcell