呋喃它酮代谢物时间分辨荧光免疫分析法的建立与应用.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第8期2016年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1286—1290DOI：10．11595／j．issn．0253~820．160192呋喃它酮代谢物时间分辨荧光免疫分析法的建立与应用邓丽华戴尽波徐振林杨金易王弘肖治理雷红涛孙远明沈玉栋(华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，广州510642)摘要建立了Eu标记的间接竞争时间分辨荧光免疫分析法(Indirectcompetitivetime—res

2、olvedfluoroimmu—noassay，ic．TRFIA)用于鱼肉样品中呋喃它酮代谢物AMOZ的检测。通过单因素实验考察了包被抗原浓度、抗体稀释倍数、竞争反应时间等参数对方法灵敏度的影响O结果表明，ic-TRFIA的最佳反应条件为：包被抗原浓度为0．25tLg／mL，抗体稀释5×10倍，最佳竞争时间为50min。在优化的条件下，方法的检出限(LOD，Ic。。)为0．O1ng／mL，半抑制浓度(Ic0)为0．26rig／mL，线性范围(Ic20一Ic80)为0．025—2．83ng／mL，对鱼样

3、中AMOZ回收率在78．0％一86．0％之间，各样品变异系数均小于15％，与HPLC—MS／MS对比检测结果显示相关性良好。本方法灵敏度高、特异性好，能够满足实际样品的检测需求。关键词呋喃它酮代谢物AMOZ；时间分辨荧光免疫分析；铕标二抗1引言呋喃它酮是硝基呋喃类抗生素的一种，曾被广泛应用于饲料添iiii及家禽、家畜、水产等养殖物传染病的预防与治疗J。但研究表明，呋喃它酮及其代谢物具有潜在的致癌和诱导机体突变的作用，且其代谢产物能与蛋白质结合，形成比原药化合物更稳定的蛋白结合物而在体内富集。但在酸陛条

4、件下，代谢物又能从蛋白质中释放出来被人体吸收而引发安全问题嵋。因此，1995年欧盟禁止了硝基呋喃类抗生素在食用动物中使用；我国也于2002年禁止了硝基呋喃类抗生素的使用，并规定在动物性食品中不得检出。尽管如此，因其高效廉价非法使用的情况却时有发生。我国出口欧盟、美国等发达国家的动物源性食品均曾被检测出此类药物残留_4l5j。因此，开展快速、廉价、灵敏、稳定的呋喃它酮及其代谢物残留检测方法研究，对呋喃它酮违禁使用监控具有重要现实意义。呋喃它酮及其代谢物的检测主要是基于液相色谱及液相色谱．质谱大型仪器的确

5、证方法，这些方法具有准确、灵敏等特点，但因其需要昂贵的仪器、耗时、需要专业操作人员等不足，难以在基层普及和应对量大面宽的食品样品检测需求。免疫学方法具有灵敏准确、特异性、高通量、低耗费等优势，适合样品的大量筛查检测，与仪器法高低搭配，形成互补。免疫分析技术应用于AMOZ检测已有相关报道，如酶联免疫分析(ELISA)⋯和化学发光酶联免疫分析(CLEIA)’J。时间分辨荧光是对荧光物质在不同时间的荧光强度和量子效率发生急剧变化的过程进行扫描，被广泛应用在蛋白质及聚合物等领域_】。时间分辨免疫分析法(TRF

6、IA)是在此基础上进一步结合高特异性免疫反应发展的一种非放射性微量分析方法，目前已应用于医学诊断、环境监测等领域卜J。该技术与ELISA易受基质干扰及CLEIA发光信号易衰减相比，镧系金属离子螯合标记物荧光持续稳定性好、强度大、Stokes位移宽、使其易通过波长分辨方式区别于背景荧光，提高了方法学的稳定性、特异性和灵敏度j。因此，在前期关于AMOZ的CLEIA方法基础上，本研究组继续开展了AMOZ的TRFIA检测方法研究。2实验部分2．1仪器与试剂WallacVICOR31420多功能标记分析仪(美国

7、PE公司)；超滤离心管(美国Millipore公司)；Well-2016-03—15收稿；2016-04—13接受本文系国家自然科学基金(Nos．31371769，31271865)和广东省科技计划项目(Nos．2014A020219008，2013B040402006，2012A020100002)资助}E-mail：sydtyx@163．COIn—第8期邓丽华等：呋喃它酮代谢物时间分辨荧光免疫分析法的建立与应用washMK2洗板机(美国Thermo公司)；超低温高速离心机(美国Eppenndorf

8、公司)。呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林、邻硝基苯甲醛、呋喃它酮代谢物邻硝基苯甲醛衍生物NPAMOZ(99．9％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；呋喃它酮代谢物AMOZ(99．9％，Sigma公司)；Eu¨．N：．[p-异氰酸一苄基]一二乙酸烯三胺四乙酸、增强液(广州市丰华生物工程有限公司)；AMOZA．OVA及其抗体(鼠单抗)由本实验室自制；其它试剂均为国产分析纯；草鱼购于当地超市。2．2实验方法2．2．1铕标二抗的制备取10mg／mL羊抗鼠I