虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法的建立.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2012年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1816～1821虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法的建立杨武英，董洁娴沈玉栋杨金易王弘徐振林杨星星孙远明(广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广州510642)(江西农业大学食品科学与工程学院，南昌330045)摘要采用对碘苯酚增强的HRP_鲁米诺一H：O化学发光体系，建立了虾肉中呋喃它酮代谢物5一吗啉甲基一3一氨基一2_恶唑烷基酮(AMOZ)残留的间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检

2、测方法。检测所用抗体是基因重组的抗AMOZ衍生物单链抗体。优化的icCLEIA最佳工作条件为：AMOZA-OVA包被浓度62．5g／L，抗AMOZ衍生物单链抗体最佳稀释度为1：10，竞争免疫反应时间45min，HRP酶标记羊抗鼠抗体最佳稀释度为1：10000，孵育时间50min。本方法的Ic5o为1-38g／L；灵敏度为O．09g／L；线性范围为O．26～9．O8g／L(IC～Icso)；批内和批间相对标准偏差均小于15％；抗AMOZ衍生物单链抗体与其它硝基呋喃类抗生素及其代谢物均没有交叉反应，特异性良好。4个不同添加量的AMOZ加标样品的平均回收率分别为72．

3、2％，73．4％，72．6％和78．6％。与HPLC—MS／MS法测定值进行比较发现，两种方法相关性良好(R一0．9997)。本方法可用于水产品中AMOZ残留的快速检测。关键词呋喃它酮代谢物AMOZ；刀额新对虾；间接竞争化学发光酶免疫分析；辣根过氧化物酶引言呋喃它酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素，主要用于畜禽和水产动物的各种肠道感染性疾病的治疗及促进生长的添加剂，曾经在畜禽水产养殖中广泛应用。有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物5一吗啉甲基一3一氨基一2_恶唑烷基酮(AMOZ)具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症】。美国、加拿大、中

4、国和欧盟的很多国家都已规定动物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ残留为不得检出。但是因为其价格低廉、疗效好，目前违法使用现象在很多国家仍然存在，故有必要对动物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ加强监控翻。由于呋喃它酮原药不稳定，进入动物体内后会被迅速代谢和分解，对原药的检测难度很大，但其代谢物AMOZ可以蛋白结合物的形式长期、稳定存在组织内，在适当的酸性条件下，这些结合残留物可以从蛋白质中释放出来，因此通常将AMOZ作为监测呋喃它酮的靶化合物。目前，AMOZ检测方法主要有色谱法[6叫]、免疫分析法等。色谱法准确、灵敏，但操作复杂、设备昂贵、检测速度慢，需要专

5、业技术人员。而免疫分析法具有简单、快速、灵敏度较高、特异性强和高通量等优点。免疫分析法的关键是高亲和力和特异性的抗体的制备，其中基因工程重组单链抗体是将天然抗体的重链可变区VH和轻链可变区vL通过一条柔软的连接肽连接成的单链分子，不仅具有高亲和力和特异性，而且还可以通过工程菌发酵快速大量制备，极大地降低了抗体生产成本，缩短了抗体生产周期。化学发光免疫分析是近十年来发展起来的一项将高灵敏度的化学发光与高特异的免疫分析相结合的新兴的免疫检测技术，具有检测特异性好、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点，能显著提高检测的灵敏度，并且比常用的其他免疫分析法的灵敏度都高卜

6、。迄今为止，文献报道的AMOZ免疫分析法都是建立在传统的多克隆或单克隆抗体基础上的ELISA法，利用重组单链抗体建立的AMOZ化2012—03—16收稿；2012—06-06接受本文系国家自然科学基金(No．30871755)、广东省科技计划项目(No．1211150100102)和广东省食品质量安全重点实验室(华南农业大学)开放基金(No．09003566)资助E—mail：gzwhongd@163．tom；gzsyming@163．tom第l2期杨武英等：虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法的建立学发光酶免疫分析方法还未见报道。本研究利用重组抗AMOZ

7、衍生物单链抗体，建立了测定虾肉中AMOZ残留的间接竞争化学发光酶免疫分析新方法。本方法简便、快速、准确、仪器设备简单，灵敏度高于ELISA法，测定结果和HPLC—MS／MS法测定结果呈现良好的相关性。2实验部分2．1仪器与试剂WallacVictor1420多标记分析仪(美国PerkinElmer公司)；WellwashMK2洗板机(美国Thermo公司)；96孔化学发光检测板条(厦门云鹏生物公司)；1200—6410A型HPLC—MS／MS联用仪(美国Agilent公司)；5417R台式高速冷冻离fi,机(德国Eppendorf公司)；JY92一IIN型超声波

8、细胞破碎仪(宁波新芝生物