呋喃它酮检测方法

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1、1设备和材料1.1设备1.1.1酶标仪（检测波长450nm，参考波长630nm）1.1.2均质器1.1.3天平，精度0.01g1.1.4旋涡振荡器1.1.5温箱（可控温度：25℃、37℃）1.1.6离心机1.1.7氮吹仪1.1.8微量移液器1.1.9计时器1.2试剂1.1.101MHCl：量取8.6mL浓盐酸，加去离子水定容至100mL。1.1.11N,N-二甲基甲酰胺（分析纯）1.1.120.1MK2HPO4：称取11.4gK2HPO4•3H2O，加400mL去离子水溶解并定容至500mL。缓冲溶液：500mL0.1MK2HPO4溶液中

2、加入100gNaCl，充分溶解备用。1.1.131MNaOH：称取4gNaOH，用去离子水溶解并定容至100mL。1.1.14乙酸乙酯（分析纯）1.1.15正己烷（分析纯）2贮存2.1.1试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻。2.1.2未使用完的微孔板条应密封，2~8℃保存。3注意事项3.1.1使用试剂盒前仔细阅读说明书。3.1.2不要使用过期试剂盒，不同批号试剂盒中的试剂不得混用。3.1.3试剂盒使用前，将试剂盒内各组份置于实验台上，待其恢复至室温（25±2℃）（提示：约2h），方可使用。3.1.4实验前，应预先开启生化培养箱调至所需温度，并

3、检查生化培养箱温度是否正常。3.1.5应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。3.1.6各试剂在使用前请摇匀。3.1.7提取药物时，涡动或摇床振摇应尽量充分；加入样品稀释液后（见8.1.9和8.2.9）应低速涡动1min，以上操作将直接影响检测结果！！3.1.8检测时，应尽量检测板孔上方空气流动。3.1.9终止液中含有2M硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。3.1.10不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。3.1.11混合试剂时应避免出现气泡。3.1.12使用后请立即将试剂放回2~8℃保存。1工作液准备1.1.150mM邻硝基

4、苯甲醛：向装有75.55mg邻硝基苯甲醛的试剂瓶中加入10mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度为50mM。1.1.2样品稀释液：用去离子水按1:4（1份浓缩液+3份去离子水）稀释。1.1.3洗涤工作液：用去离子水按1:20（1份浓缩液+19份去离子水）稀释。1.1.4样品前处理1.2组织（猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉）1.2.1准确称取1±0.01g均质后的组织样品于50mL离心管中；1.2.2依次加入4mL去离子水、0.5mL1MHCl、80μL50mM邻硝基苯甲醛（见7.1），充分涡动至组织分散；1.2.337℃温箱孵育16h；1.2.4依次

5、加入5mL缓冲溶液（见4.2.3~4.2.4）、400μL1MNaOH和6mL乙酸乙酯；1.2.5室温（25±2℃）下，剧烈涡动1min（或摇床300rpm振摇10min）；1.2.64000g以上，离心10min；1.2.7取3mL上清于新的离心管中；1.2.850-60℃水浴中，氮气吹干；1.2.9加入2mL正己烷，充分涡动10s，再加入1mL样品稀释液，低速涡动1min；1.2.104000g以上，离心5min；注意事项：高脂肪组织易发生乳化，可根据情况加大正己烷用量；离心后如仍有乳化现象，可于80℃水浴加热5min，并再次离心。1

6、.2.11完全弃去上层正己烷及中间杂质；1.2.12取50μL进行检测。1.3蜂蜜（原蜜、成品蜜）1.3.1准确称取1±0.01g蜂蜜样品于50mL离心管中；1.3.2依次加入10mL去离子水、0.5mL1MHCl、80μL50mM邻硝基苯甲醛（见7.1），充分涡动至蜂蜜分散（注意：涡动须充分，使蜂蜜完全溶解！！）；1.3.337℃温箱孵育16h；1.3.4依次加入5mL缓冲溶液（见4.2.3~4.2.4）、400μL1MNaOH和6mL乙酸乙酯；1.3.5室温（25±2℃）下，剧烈涡动1min（或摇床300rpm振摇10min）；1.3

7、.64000g以上，离心10min；取3mL上清于新的离心管中（注意：吸取时一定要小心，避免吸到下层杂质，否则将影响检测结果！！）；1.3.750-60℃水浴中，氮气吹干；1.3.8加入3mL正己烷，充分涡动10s，再加入1mL样品稀释液，低速涡动1min；1.3.94000g以上，离心5min；1.3.10完全弃去上层正己烷及中间杂质；1.3.11取50μL进行检测。2检测1.1.1将所需的酶标板条插入酶标板架上，未使用的酶标板条用自封袋密封后，立即保存于2-8℃环境中，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做平行实验；1.1.2将50μ

8、L各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；1.1.3在每个板孔中加入50μL呋喃它酮代谢物酶结合物；1.1.4盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），