时间分辨荧光免疫分析法检测血清透明质酸的方法建立和临床应用

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1、·264·液中同型半胱氨酸含量上升，甲硫氨酸含量下降，进一步影响DNA、RNA的合成及DNA的甲基化。近年来的研究发现，MTHFR基因多态性与神经管缺陷、心脑血管疾病以及多种肿瘤的发生之间存在显著的关系，特别是MTt-IFR基因多态性与肿瘤易感性之间的关系已成为研究的热点。C677T位点的突变，将导致MTHFR的活性降低，可引起血液中5一甲基四氢叶酸降低和同型半胱氨酸堆积，从而改变DNA的甲基化水平，导致基因表达水平异常，因此检测MTHFR基因的多态性具有重要的意义。利用寡核苷酸探针检测基因多态性是一种常用的方法，在适当条件下，寡核苷酸探针

2、可以检测出单个碱基的改变。寡核苷酸探针检测单个碱基改变的关键是要保证杂交条件的严格性，其中杂交温度是最主要的影响因素，温度越高杂交体越不稳定，越容易区分出单个碱基的错配，但过高的温度会降低检测的灵敏度。本方法选择的杂交温度为48℃，既保证了检测的特异性，又具有较高的灵敏度。不同的碱基错配对Tm值的影响不同，GT错配较A-C错配对杂交体的稳定性影响小。在MTHFR基因C677T位点，野生型样品与突变型探针的错配为A-C错配，而突变型样品与野生型探针的错配为GT错配，故杂合型样品的比值大子l，而野生型样品的比值远大于1，突变型样品的比值小于1。

3、我们用本研究建立的方法检测了50份标本的MTHFR基因C677T位点多态性，三种基因型样品的比值可以严格区分，检测结果与参考方法的检测结果完全一致。等位基因特异性扩增(ASA)法需要两个扩增体系，扩增条件的差异有时会导致结果判断困难；周新文等在ASA法的基础上采用ASA-ELISA及化学发光法检测，提高了ASA法的检测灵敏度。本法采用错配杂交法检测基因多态性，只用一个扩增体系，具有操作简便，不需凝胶电泳且费用低廉(一个样品的检测费用不超过人民币lO元)，检测结果准确等优点，可以作为一种检测基因多态性及基因突变的常用方法。时间分辨荧光免疫分析

4、法检测血清透明质酸的方法建立和临床应用裴豪黄飙蒋祥虎朱岚钱金娟季瑞云陈铁河葛东波李荔透明质酸(h刘uronicacid，HA)是肝脏细胞外间质中蛋白多糖的一个组成部分。由肝内间质细胞合成，内皮细胞参与降解。其血清含量对判明肝脏纤维程度，判别有无肝硬化具有一定的意义。HA的检测方法主要为放射免疫法(RIA)，由于受标记物的稳定性，测量范围，放射性污染等因素的影响，存在一定的局限性。目前国内外尚无运用时间分辨免疫分析技术(n心n)检测HA的报道，为此经过探索和研究，我们建立竞争HA-TRFIA检测，并探讨其在肝纤维化及肝硬化诊断中的应用价值。对

5、象和方法1．对象：无锡市传染病医院住院和门诊病人120例。男性的84例，女性的36例；年龄11～80岁的。急性肝炎28例，慢性肝炎71例，其中慢性轻度25例、中度24例、重度22例，肝硬化21例。诊断符合2000年西安会议病毒性肝炎防治方案修订的诊断标准。30例正常献血员为我院健康体检人员，男性16例，女性14例，年龄18--60岁。均静脉采血2毫升，分离血清，一20。C保存待检。2．试剂和仪器：HA、HA结合蛋白、HA结合蛋白抗体、HA参考标准，HA高、中、低质控品，上海海军医学研究所提供。羊抗兔IgG，华美生物工程公司产品。Eu3+标记

6、盒(1244—302)，WALLAC产品。96孔微孔板，Nunc产品。牛血清蛋白(琰认)，sigma产品。HA-BSA，发光增强液，浓缩洗涤液。反应缓冲液，江苏省原子医学研究所提供。其余试剂为国产分析纯试剂。全自动TRFIA检测仪(AntoDELFIAa235)基金项目：江苏省社会发展基金资助项目(BS2004009)作者单位：214005无锡市传染病医院检验科(裴豪、蒋祥虎、钱金娟、季瑞云、李荔)；江苏省原子医学研究所(黄飕、朱岚)；上海海研医学生物技术有限公司(陈铁河、葛东波)为美国Perkirnelmer的产品。放射免疫分析仪为北京产

7、FT一630G。HA放免试剂盒上海海军医学研究所提供，按说明书进行操作。3．Eu3+一BSA-HA的制备：取500pgHA—BSA加入含0．2rng的Eu3+一N2一二乙烯三胺四乙酸(Eu3+一DTTA)冻干粉的小瓶中，30℃磁力搅拌反应16小时。反应液经用80mrr妁l／LTris-HClPm．8缓冲液平衡的SephamseCL-6B柱(1×40crn)层析，A280监测收集蛋白峰。4．固相抗体的制备：将羊抗兔IgG，用50mmol／LPH9．6Na2(303一NaHC03缓冲液稀释至10rng／L，在96孔微孔板各孔中加入200ul，4

8、。C过夜，弃去包被液洗涤三次，每孔加200ul含39／LBSA的缓冲液封闭，4。C过夜，弃取封闭液真空抽干后冷冻保存。5．HA-TRFIA法的建立：在包被二抗的微孔板中加入用反应