耐冷菌Pseudomonas sp.W7产低温蛋白酶水解牛骨蛋白研究.pdf

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1、中文摘要我国骨资源丰富，但是在骨资源利用上存在极大的浪费，酶解骨蛋白生产高质量的蛋白胨，是一条提高畜骨资源利用的有效途径。蛋白胨是蛋白质经水解之后形成的由际、胨、多肽和氨基酸等组成的混合物，主要用于各种微生物的培养提供N源。本研究采用低温蛋白酶水解牛骨蛋白，利用单因素实验研究在不同温度，pn，酶的添加量，反应时间对牛骨蛋白水解的影响，并在此基础上，筛选出3个对酶解效果影响显著的因素：温度、时间、pH；进一步利用响应面法对筛选出的因素进行3因素3水平优化，获得低温蛋白酶水解牛骨蛋白的最优条件为：温度38℃，时间77min，pH7．1，酶的添加量150U／mL。优化后，测得牛骨蛋白水解产物的氨态氮

2、含量达到4．55％。为了迸一步考察低温蛋白酶水解牛骨蛋白过程中各因素之间的相互作用，本文设计了水解动力学实验，根据实验数据及公式推导得到低温蛋白酶水解牛骨蛋白的动力学勰鲁2aexp(-bh)2意鲁哦丽1．17h时黼慨常数Km为0．79／L，Km较小，表明酶与底物的亲和度比较大；最大反应速率Vmax为0．541mol／L．rain，Vmax较大，表明酶解反应能够很快到达反应终点；测得反应活化能Ea为4．012KJ／mol，活化能较低，说明低温蛋白酶对温度比较敏感，高温容易使酶失去活性。酶解动力学实验结果为日后发酵生产提供参数依据，采用低温蛋白酶，水解温度一般低于中温酶，同时所用的水解时间很短。目

3、前蛋白胨产品主要以氨氮、总氮含量作为质量检测的指标，而蛋白胨中多肽片段大小及分布显著影响微生物对蛋白胨的利用。本文对牛骨蛋白水解产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果表明水解液中的肽段呈连续性分布，在200KDa一6．5KDa之间均有分布，随着时间的延长，大分子的肽段逐渐被水解成小分子的肽段。为了进一步确定水解产物的肽段分布，本实验选取SephadexG一100、SephadexG．50，SephadexG一25三种分子量范围不同的凝胶层析，测得牛骨蛋白水解物中多肽分布为：45KDa-150KDa的多肽占牛骨蛋白胨总量的14．83％，11．7KDa-45KDa的多肽30．37％，1KDa．

4、11．7K．Da的多肽34．16％，小于1KDa的多肽10．74％。氨基酸含量检测结果表明：牛骨蛋白水解后游离氨基酸总量高于水解前游离氨基酸的60．21％，其中必需氨基酸占总量的26．72％，半必需氨基酸占总量的5．02％，鲜味氨基酸占46．3％，苦味氨基酸占34．57％。与商品蛋白胨(国产)和胰蛋白胨(进口)对比结果显示，牛骨蛋白胨的氨态氮含量高，但是葡聚糖层析结果显示牛骨蛋白水解液中小分子多肽含量低于商品蛋白胨和胰蛋白胨，氨基酸分析结果表明牛骨蛋白水解后游离氨基酸含量均明显高于商品蛋白胨和胰蛋白胨。这一点也解释了为什么低温蛋白酶水解牛骨蛋白产物检测氨态氮含量高；而小分子多肽片段分布少。关键

5、词：牛骨蛋白，低温蛋白酶，酶解反应动力学，多肽分布，游离氨基酸；AbstractBoneresourcesareveryrichinChina,butthereisagreatwasteintheutilizationofboneresources：Enzymatichydrolysisofboneproteinisalleffectivewaytoimprovetheutilizationofanimalboneresources，whichproduceshighqualityproteinpeptone．Peptoneisamixtureofnitrogensourcecomposedb

6、ytheproteose，peptone，polypeptide，aminoacidthatformedafterenzymehydrolysis．ItcanprovidetheNsourceformicrobialgrowth．Inthisstudy,lowtemperatureproteaseWasusedtohydrolyzebovineprotein．ThesinglefactorexperimentswereconsideredaccordingtopH，temperature，enzymeadditionandreactiontimetooptimizetheconditionfo

7、rbovine-bonepeptonehydrolysis．Basedontheresultsofsignlefactoroptimization，3importantfactorswereselectedwhichaffectammonianitrogensignificantly,pH，temperatureandreactiontime．Theoptimumhydrolysiscondito