耐冷假单胞菌Pseudomonas sp.G6产脂肪酶条件优化及其酶学性质研究.pdf

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1、中文捅要中文摘要脂肪酶是一类能将长链脂肪酸甘油酯催化水解为甘油和脂肪酸的甘油酯键水解酶。广泛用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。目前研究和应用的脂肪酶多为中温脂肪酶，酶的最适温度一般在40"12以上，在0"C左右没有酶活性。相比之下，低温脂肪酶在低温下仍然具有较高酶活性，其最适温度在30"C左右，在O℃左右有一定的催化活性。因此在食品脱脂、环境修复和洗涤添加剂等方面应用具有优势，近年来引起了广泛关注。本文首先从实验室保存的耐冷菌中筛选脂肪酶的产生菌株，利用罗丹明B平板法筛选出产脂肪酶较好的4株茵命名为G6

2、，H8，Z4和W7。对产脂肪酶活力最高的G6进行菌种鉴定。对其进行形态学和生理生化鉴定，结合部分16SrDNA序列分析，确定其为假单胞茵属，命名为耐冷假单胞茵Pseudomonassp．G6。为了提高菌株产酶能力，在摇瓶发酵水平上，对耐冷假单胞菌Pseudomonas印．G6产酶条件进行了研究。利用单因素实验研究不同碳源、氮源、无机盐对产酶的影响，确定产酶培养基的组成为葡萄糖5．0g．U1，O'a-Lhs041．0g．L-1，蛋白胨10g-L"1，K2HP041．0g-L-1，吐温8010mL·L-1，Mg

3、S042．0g-L-1，NaCl2．0g-L-1。确定最佳的产酶培养条件为培养温度20℃；培养基的初始pH值7．5；接种量2％；装液量20*／0；摇床转速100rpm。在最佳的培养条件下，培养24h时产酶达到最大值为65．66U-mL一。在单因素实验研究的基础上，采用响应面法优化产酶条件。得到耐冷假单胞菌Pseudomonassp．G6最佳产酶条件为葡萄糖5．0g-L-1，蛋白胨12g-L"1,K2HP041．0g'L～，MgS042．0g-L1，(NFhhS041．0g-L一,NaCll．2g-L-1，吐

4、温8010mL·L一，转速110rpm，装液量20％，接菌量2％，培养基pH7．5，培养温度20℃。最佳条件下产酶水平达到107．03U·mL～。对耐冷假单胞菌Pseudomonassp．G6所产的脂肪酶进行分离纯化研究。菌体发酵上清液经丙酮沉淀、透析浓缩、高速逆流色谱技术等步骤的处理，得到纯化的脂肪酶，SDS-PAGE检测其纯度为电泳纯，得到酶蛋白的分子量大约为65KDa。㈣㈣黑龙江大学硕士学位论文～～～对纯化后的酶进行性质研究，结果表明：此酶的最适酶解温度为30℃，在5℃相对酶活30％；对热敏感，50℃

5、以上处理30min后相对酶活仅残留不到20％；最适pH为7．5，pH在7-8范围内酶活相对比较稳定；金属离子Mn2+对酶活力促进效果最佳，而Cu2+、H92+、Fe”、zn2+对酶活力有抑制作用；有机溶剂吐温80、EDTA、SDS和Tritonx-100对酶的活力均有抑制作用。关键词：低温脂肪酶；菌株鉴定；产酶条件优化；分离纯化；酶学性质AbstractLipasecouldhydrolyzetriglycercidetoglycerolandfattyacidwhichiswidelyappliedtoi

6、ndustrialproductionsuchasfood，fats,medicineandchemical．Thepresentresearchonlipaseismainlyfocusedonmedium-temperaturelipase，whoseoptimaltemperatureofhydrolyzationisaround40。C，andhasnocatalyticactivityatlowtemperature．Thecold—adaptedlipasehasthefeatureofhave

7、ahighcatalyticactivityatlowtemperature，andstillhavecatalyticactivityatO*C．Thismakescold-adaptedlipasetakeadvantagesofapplyingtofatprocesses，environmentalrestorationanddetergents，italsoarouseswidelyattentionsinrecentyearsInthispaper,4strainsofpsychrotrophic

8、bacteriawereidentifiedaslipase．producingbacteriawithhighcapabilityofproducingcold—adaptedlipase，separatedlynamedG6，H8，Z4andW7byusingthemethodofRhodamineB．ThestrainG6wasprovedtobewiththehighestlipaseactivity,a