肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2 ］i 变化及其机制探析.doc

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1、肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞[Ca2+]i变化及其机制探析【摘要】目的：研究肺纤维化(PF)大鼠肺微血管内皮细胞内的Ca2+变化，探讨其在PF中的作用机制.方法：SD大鼠20只，随机分为PF组和对照组，每组10只动物，按5mg/kg体质量分别气管滴注博莱霉素及等量生理盐水，取外周肺组织原代培养肺微血管内皮细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内[Ca2+]i及中电导钙激活钾通道蛋白1(IKcal)表达，计算机图像分析免疫细胞化学法IKcal的表达.结果：激光扫描共聚焦显微镜检测PMVECs内[Ca2+]i:PF组为(1

2、66.56±24.17)明显高于对照组(95.79±13.51),两组比较差异具有统计学意义(P<；0.01).间接免疫荧光法检测IKcal表达：PF组为(679.29±206.98)明显低于对照组(958.75±188.84),两组比较差异具有统计学意义(P<；0.01)；免疫细胞化学检测IKcal表达：PF组(169.08土14.81)明显低于对照组(189.78±13.73),两组比较差异具有统计学意义(P<；0.01).结论：PF时，肺微血管内皮细胞[Ca2+]i过载，其发生机制可能与IKca活性异

3、常有关.【关键词】肺纤维化；肺微血管内皮细胞；[Ca2+]i；中电导钙激活钾通道蛋白10引言近年来对肺纤维化(pulmonaryfibrosis,PF)发病机制的研究主要集中于多种细胞及细胞因子的相互作用等方面[1].但有关肺微血管内皮细胞(pulmonarymicrovascularendothelialcells,PMVECs)在PF中作用的研究报道甚少.中电导钙激活钾通道(intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannel,IKca)对PMVECs膜电位的稳定

4、和细胞内[Ca2+]i的调节具有重要作用[2].博莱霉素(bleomycin,BLM)对组织的损伤具有持续性[3]•我们采用BLM建立大鼠PF模型，利用细胞培养，激光共聚焦技术检测PF时PMVECs内[Ca2+]i的变化，同时检测原代培养PMVECs的中电导钙激活钾通道蛋白质1(intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannelprotein1,IKcal)表达，以期探讨PMVECs在PF发病机制中的作用.1材料和方法1.1材料SD大鼠20只，体质量(150±20)

5、g,雌雄不拘(第四军医大学实验动物中心)；BLMA5粉剂(8mg/支，批号041103,天津太河制药)；DMEM培养基、胰酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；兔抗鼠vm因子多克隆抗体（北京中山生物试剂公司）；Fura3/AM（美国MolecularProbe公司）；兔抗IKca多克隆抗体，FITC羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；IX70型激光共聚焦扫描仪、光学显微镜、倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）.1.2方法1.2.1PF模型的建立将大鼠随机分为对照组和PF组，每组各1

6、0只.BLMA5用生理盐水稀释成4g/L,按5mg/kg体质量气管内滴入0.15~0.2mL.对照组气管内滴入等量生理盐水，2wk后取肺组织做HE及Masson染色，光镜检查.1.2.2PMVECS培养及鉴定按参考文献［4］的方法取大鼠外周肺组织，修剪成1mmX1mmX1mm大小组织块，置于培养液预湿的盖玻片上，孵箱内静置2h后加入含200mL/L胎牛血清的DMEM培养液继续培养，60h后去除组织块并换液，待细胞汇合成单层后取出备用•倒置显微镜下观察，抗VDI因子抗体免疫细胞化学染色鉴定.实验及鉴定均采用原代细胞.1.

7、2.3PMVECsLCa2+］i检测PBS洗3次，加入100uLFluo2/AM工作液，孵育40min,PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光强度.1.2.4间接免疫荧光染色细胞爬片乙醇固定，染色步骤按试剂盒说明进行.兔抗IKcal多克隆抗体及FITC羊抗兔IgG工作浓度分别为1：15,1：32,空白对照用PBS代替一抗，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察.1.2.5免疫细胞化学染色细胞爬片冷丙酮固定，染色步骤按试剂盒说明进行(SABC法)，兔抗IKcal多克隆抗体工作浓度1：30.采用计算机图像分析后苏木

8、素轻度复染，脱水，透明，封片.统计学处理：应用SPSS10.5软件，两组均数比较采用t检验，P<；0.05为差异有统计学意义.2结果2.1肺组织光镜观察HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚；PF组部分肺泡腔消失，肺泡壁明显增厚，其中可见胶原纤维沉积;Masson染色对照组肺泡组织结构完整，肺间质中可见少量染成蓝色的胶原纤维