肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［ca2+］i 变化及其机制探讨

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1、肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2+］i变化及其机制探讨【摘要】目的：研究肺纤维化(PF)大鼠肺微血管内皮细胞内的Ca2+变化，探讨其在PF中的作用机制.方法：SD大鼠20只，随机分为PF组和对照组，每组10只动物，按5mg/kg体质量分别气管滴注博莱霉素及等量生理盐水，取外周肺组织原代培养肺微血管内皮细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内［Ca2+］i及中电导钙激活钾通道蛋白1（IKca1）表达，计算机图像分析免疫细胞化学法IKca1的表达.结果：激光扫描共聚焦显微镜检测PMVECs内［Ca2+］i：PF组为（166.56±24.17）明显高于对照组（95.79±13.51），

2、两组比较差异具有统计学意义（P<0.01).间接免疫荧光法检测IKca1表达：PF组为（679.29±206.98）明显低于对照组（958.75±188.84），两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；免疫细胞化学检测IKca1表达：PF组（169.08±14.81）明显低于对照组（189.78±13.73），两组比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论：PF时，肺微血管内皮细胞［Ca2+］i过载，其发生机制可能与IKca活性异常有关.【关键词】肺纤维化；肺微血管内皮细胞；［Ca2+］i；中电导钙激活钾通道蛋白1　　0引言　　近年来对肺纤维化（pulmona

3、ryfibrosis，PF）发病机制的研究主要集中于多种细胞及细胞因子的相互作用等方面［1］.但有关肺微血管内皮细胞（pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）在PF中作用的研究报道甚少.中电导钙激活钾通道（intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannel，IKca）对PMVECs膜电位的稳定和细胞内［Ca2+］i的调节具有重要作用［2］.博莱霉素（bleomycin，BLM）对组织的损伤具有持续性［3］.我们采用BLM建立大鼠PF模型，利用细胞培养，激光共聚焦技术检测PF时P

4、MVECs内［Ca2+］i的变化，同时检测原代培养PMVECs的中电导钙激活钾通道蛋白质1（intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannelprotEin1，IKca1）表达，以期探讨PMVECs在PF发病机制中的作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD大鼠20只，体质量(150±20)g，雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）；BLMA5粉剂（8mg/支，批号041103，天津太河制药）；DMEM培养基、胰酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体（北京中山生物试剂公司）；Fur

5、a3/AM（美国MolecularProbe公司）；兔抗IKca多克隆抗体，FITC羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；IX70型激光共聚焦扫描仪、光学显微镜、倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）.　　1.2方法　　1.2.1PF模型的建立　　将大鼠随机分为对照组和PF组，每组各10只.BLMA5用生理盐水稀释成4g/L，按5mg/kg体质量气管内滴入0.15~0.2mL.对照组气管内滴入等量生理盐水，2m×1mm×1mm大小组织块，置于培养液预湿的盖玻片上，孵箱内静置2h后加入含200mL/L胎牛血清的DMEM培养液继续培养，60h后去除组织块并换液，待细胞汇合成

6、单层后取出备用.倒置显微镜下观察，抗Ⅷ因子抗体免疫细胞化学染色鉴定.实验及鉴定均采用原代细胞.　　1.2.3PMVECs［Ca2+］i检测　　PBS洗3次，加入100μLFluo2/AM工作液，孵育40min，PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光强度.　　1.2.4间接免疫荧光染色　　细胞爬片乙醇固定，染色步骤按试剂盒说明进行.兔抗IKca1多克隆抗体及FITC羊抗兔IgG工作浓度分别为1∶15，1∶32，空白对照用PBS代替一抗，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察.　　1.2.5免疫细胞化学染色　　细胞爬片冷丙酮固定，染色步骤按试剂盒说明进行(SABC法)，兔抗I

7、Kca1多克隆抗体工作浓度1∶30.采用计算机图像分析后苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.　　统计学处理:应用SPSS10.5软件，两组均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1肺组织光镜观察　　HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚；PF组部分肺泡腔消失，肺泡壁明显增厚，其中可见胶原纤维沉积；Masson染色对照组肺泡组织结构完整，肺间质中可见少量染成蓝色的胶原纤维；PF组肺组织结构紊乱，可见大量胶原纤维沉积于肺间质