肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［ca2+］i 变化及其机制探讨论文

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1、肺纤维化大鼠肺微血管内皮细胞［Ca2+］i变化及其机制探讨论文【摘要】目的：研究肺纤维化(PF)大鼠肺微血管内皮细胞内的Ca2+变化，探讨其在PF中的作用机制.方法：SD大鼠20只，随机分为PF组和对照组，每组10只动物，按5mg/kg体质量分别气管滴注博莱霉素及等量生理盐水，取外周肺组织原代培养肺微血管内皮细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内［Ca2+］i及中电导钙激活钾通道蛋白1（IKca1）表达，计算机图像分析免疫细胞化学法IKca1的表达.结果：激光扫描共聚焦显微镜检测PMVECs内［Ca2+］i：PF组为（166.56±

2、24.17）明显高于对照组（95.79±13.51）.freelonaryfibrosis，PF）发病机制的研究主要集中于多种细胞及细胞因子的相互作用等方面［1］.但有关肺微血管内皮细胞（pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）在PF中作用的研究报道甚少.中电导钙激活钾通道（intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannel，IKca）对PMVECs膜电位的稳定和细胞内［Ca2+］i的调节具有重要作用［2］.博莱霉素（bleom

3、ycin，BLM）对组织的损伤具有持续性［3］.我们采用BLM建立大鼠PF模型，利用细胞培养，激光共聚焦技术检测PF时PMVECs内［Ca2+］i的变化，同时检测原代培养PMVECs的中电导钙激活钾通道蛋白质1（intermediateconductanceCa2+activatedpotassiumchannelprotein1，IKca1）表达，以期探讨PMVECs在PF发病机制中的作用.1材料和方法1.1材料SD大鼠20只，体质量(150±20)g，雌雄不拘（第四军医大学实验动物中心）；BLMA5粉剂（8mg/支，批号0411

4、03，天津太河制药）；DMEM培养基、胰酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体（北京中山生物试剂公司）；Fura3/AM（美国MolecularProbe公司）；兔抗IKca多克隆抗体，FITC羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；IX70型激光共聚焦扫描仪、光学显微镜、倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）.1.2方法1.2.1PF模型的建立将大鼠随机分为对照组和PF组，每组各10只.BLMA5用生理盐水稀释成4g/L，按5mg/kg体质量气管内滴入0.15~0.2mL.

5、对照组气管内滴入等量生理盐水，2m×1mm×1mm大小组织块，置于培养液预湿的盖玻片上，孵箱内静置2h后加入含200mL/L胎牛血清的DMEM培养液继续培养，60h后去除组织块并换液，待细胞汇合成单层后取出备用.倒置显微镜下观察，抗Ⅷ因子抗体免疫细胞化学染色鉴定.实验及鉴定均采用原代细胞.1.2.3PMVECs［Ca2+］i检测PBS洗3次，加入100μLFluo2/AM工作液，孵育40min，PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞荧光强度.1.2.4间接免疫荧光染色细胞爬片乙醇固定，染色步骤按试剂盒说明进行.兔抗IKca1多克

6、隆抗体及FITC羊抗兔IgG工作浓度分别为1∶15，1∶32，空白对照用PBS代替一抗，缓冲甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察.1.2.5免疫细胞化学染色细胞爬片冷丙酮固定，染色步骤按试剂盒说明进行(SABC法)，兔抗IKca1多克隆抗体工作浓度1∶30.采用计算机图像分析后苏木素轻度复染，脱水，透明，封片.统计学处理:应用SPSS10.5软件，两组均数比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义.2结果2.1肺组织光镜观察HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚；PF组部分肺泡腔消失，肺泡壁明显增厚，其中可见胶原纤维沉积；Mass

7、on染色对照组肺泡组织结构完整，肺间质中可见少量染成蓝色的胶原纤维；PF组肺组织结构紊乱，可见大量胶原纤维沉积于肺间质内.2.2PMVECs鉴定原代培养的内皮细胞呈铺路石样从组织块边缘爬出，透光性好，周边可见少许成纤维细胞（图1A）.Ⅷ因子免疫细胞化学染色见细胞胞浆内呈棕黄色染色（图1B）.2.3［Ca2+］i测定游离Ca2+主要位于内皮细胞胞质内.PMVECs内［Ca2+］i对照组为95.79±13.51，PF组为166.56±24.17，两组比较差异具有统计学意义（n=9，t=7.668，P0.01，图2）.2.4IKca1表达I

8、Kca1主要在细胞膜上表达.计算机图像分析平均灰度值对照组为189.78±13.73（n1=83），PF组为169.08±14.81（n2=88），两组比较差异具有统计学意义（t=9.486，P0.01）；平均荧光强度对