OPG对破骨细胞分化过程中细胞骨架的影响及其分子机理.pdf

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1、万方数据OPG对破骨细胞分化过程中细胞骨架的影响及其分子机理InfluencesofosteoprotegerinonthecytoskeletonofosteoclastandtheinvolveS19na儿1ng1)a，tnWaVSinmeDrocess0t’-，’．，lrInstenClaStdltterentlatlnn11●，、，、●研究生：宋瑞龙导师：刘宗平教授专业：临床兽医学资助项目：国家自然科学基金(31172373，31372495)江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(2012)扬州大学2014年6月万方数据宋瑞龙：OPG对破骨细胞分化过程中细胞骨架的影响及其分子机

2、理中文摘要破骨细胞(osteoclast，OC)具有独特的骨吸收活性，其骨吸收与成骨细胞骨形成之间i‘的动态平衡在机体骨重建过程中扮演着重要的角色。破骨细胞数量或功能活性的过度增加会造成多种骨类疾病，如骨质疏松、风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、牙周炎等。因此，对破骨细胞分化和骨吸收的研究具有重要的临床意义。在机体生理或者病理条件下，成骨细胞或者基质细胞膜上的细胞核因子．KB受体活化因子配体(recetoractivatorofnuclearfactor．KBligand，RANKL)与破骨细胞前体细胞细胞膜上的细胞核因子一KB受体因子(recetoractivatorofnuclearfact

3、or．nB，RANK)结合，促进破骨细胞分化和成熟。成骨细胞分泌的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是RANKL的诱饵受体，能与RANK竞争RANKL，从而抑制破骨细胞的分化、成熟以及骨吸收活性。细胞骨架是真核细胞胞质中错综复杂的网络结构，在细胞形态和迁移等方面起着至关重要的作用。细胞骨架参与细胞内物质运输、信息传递、能量转换、细胞分化与分裂等活动。研究表明，破骨细胞的骨吸收活性与细胞骨架密切相关。目前关于OPG对破骨细胞骨吸收影响的研究主要集中在OPG能够通过0PG／RANKL／RANK系统抑制破骨细胞的分化从而影响破骨细胞的骨吸收功能。虽然细胞骨架在破骨细胞分化和骨吸收

4、过程中扮演着重要的角色，但是在这个过程中，关于细胞骨架的变化和OPG对细胞骨架的影响仍不清楚。本论文旨在研究破骨细胞分化过程中细胞骨架的变化和RhoGTPases家族的调控作用以及OPG的作用，为揭示OPG抑制破骨细胞分化的分子机理提供科学依据。1．破骨细胞的诱导培养与纯化破骨细胞是终末细胞，不能够分裂增殖，体内含量极少。为了获得大量有活力的破骨细胞(osteoclast，OC)，建立了利用RANKL和M—CSF诱导RAW264．7细胞分化为破骨细胞的方法。为了利用RAW264．7细胞获得大量破骨细胞，将RAW264．7细胞接种到6孔板中，密度分别为4X103、8X103和1．6X104个

5、／mL，同时添加利用60ng／mLRANKL和50ng／mLM．CSF处理细胞。结果表明，1．6X104个／mL、8×103个／mL和4×103个／mL的细胞密度分别培养2d、3d和4d后，出现大量的单核细胞凋亡并伴随破骨细胞产生。结果表明4×103个／mL接种密度下，破骨细胞产生的数量最多。这说明低接种密度和长时间的诱导有利于破骨细胞的形成。万方数据旦宋瑞龙：0PG对破骨细胞分化过程中细胞骨架的影响及其分子机理2．破骨细胞分化过程中细胞骨架的变化用RAW264．7细胞诱导破骨细胞，采用RTCA、TRAP染色、免疫荧光染色、QRT-PCR等技术分别检测了破骨细胞分化过程中的细胞形态学和骨架

6、结构，以及RhoGTPases家族、破骨细胞分化和骨吸收相关酶的表达。结果表明，在诱导破骨细胞分化过程中，细胞骨架、细胞形态和相关调节因子的表达均发生了剧烈的变化，根据细胞形态将破骨细胞分化成熟的过程分为4个阶段；(1)由未分化的RAW264．7诱导为破骨细胞前体细胞的过程，即O～ld：(2)破骨细胞前体细胞潜伏期，即1～3d；(3)破骨细胞前体细胞转化为未成熟破骨细胞的过程，即3～4d：(4)破骨细胞成熟过程，即4～6d。在破骨细胞前体细胞中，有三种类型的丝状伪足，在未分化的细胞中仅有一种类型的丝状伪足，而成熟后的破骨细胞则丝状伪足完全消失。相互融合的细胞是具有选择性的，并且融合首先发生

7、于丝状伪足。丝状伪足和伪足小体不仅在细胞的迁移和封闭带的形成过程中起着重要的作用，而且在细胞融合前的相互选择和融合中细胞核与细胞浆的移动方向上扮演着重要的角色。另外，Cdc42vl、RhoU和RhoF分别调节着三种不同类型丝状伪足的形成，而Racl、Rac2和FLNA可能与细胞的选择性有关。3．RAw264．7细胞诱导分化为破骨细胞过程中的调控机制在RAW264．7细胞诱导分化为破骨细胞的过程中，用霍夫曼显微镜拍摄技术、