咖啡酸对破骨细胞形成与分化的影响

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1、录············，··························001······-···································4化的影响⋯······························⋯······8材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果·⋯⋯⋯⋯··············⋯··⋯···⋯····-·······⋯···⋯⋯⋯·····⋯··15附l药··⋯····000···⋯········⋯⋯⋯····⋯⋯⋯⋯⋯···········⋯⋯⋯·16附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯·⋯l9讨论一”⋯⋯⋯⋯⋯⋯”一一“”一”“一“”一””一””一”⋯⋯“一““一“21结论⋯⋯⋯⋯⋯·····························⋯⋯⋯⋯···一·一··············23参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23综述破骨细胞的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24致谢···⋯·····⋯⋯⋯⋯·············⋯·⋯···⋯··⋯⋯⋯··⋯⋯·一·一·······39个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40中文摘要咖啡酸对破

3、骨细胞形成及分化的影响摘要目的：利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系，研究咖啡酸对体外培养的破骨细胞和破骨前驱细胞形成及分化的影响，为以破骨细胞活性增强为主的骨吸收性疾病的预防和治疗提供一种新制剂，为今后进一步研究破骨细胞及相关疾病打下基础。方法：选用4周龄SD雄性大鼠(体重约80．1209)，利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系，在10一Molla，25(OH)2D3和破骨细胞分化因子s黜ⅢKL存在下，进行体外破骨细胞诱导培养，观察咖啡酸对破骨细胞和破骨前驱细胞形成及分化的影响。l细胞培养及药物添加1．1全骨髓细胞培养系取4周龄SD雄性大鼠一只(

4、8旺1209)，用异氟烷麻醉后，在无菌条件下取其胫骨和股骨，去掉骨垢端暴露骨髓腔，然后用10ml无菌注射器抽取不含血清的仅．MEM培养液冲洗骨髓腔，制取全骨髓细胞，1500转／分离心5分钟后，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的0【一MEM培养液20ml，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，细胞计数板计算细胞数，算出细胞原液浓度，然后配制成浓度为2×106cells／ml的细胞悬液lml，加入破骨细胞分化因子(s凡州KL)和活化型双羟维生素D，(1a，25(OH)2D3)，使其终浓度分别为20ng／ml和10一M／ml，将细胞播种于24孔培养板中，每孔加入浓度为2

5、×106cells／ml的细胞悬液0．5ml(每孔1X106cells)。细胞播种后将培养板置于37。C、5％C02培养箱中培养，培养过程中严格保持培养箱内无菌及饱和湿度，培养至第4天时更换培养液一次，共培养7天。1．2破骨前驱细胞培养系全骨髓细胞制备后，离心浓缩为2ml，然后注入葡聚糖凝胶柱G10(SephadexG10)中过滤，除去骨髓间质细胞，搜集非附着性骨髓细胞10—12ml，计算细胞数，然后配制浓度为2×106／ml的细胞悬液13ml，添加破骨细胞分化因子(sRANl也)和活化型双羟维生素D3(1a，25(OH)中文摘要2D3)，使其终浓度分别为

6、20ng／ml和10一M／ml，将细胞悬液播种于24孔培养板中，每孔加入细胞悬液0．5ml(1×106cells)。然后将培养板放入37℃、5％C02培养箱中培养，培养至第4天时更换培养液一次，共计培养7天。1．3药物添加在播种有两种细胞培养系细胞的24孔培养板中添加药物咖啡酸，使其浓度分别为O，O．5，1，lO，50，100ug／ml，共4行6列，每行6个浓度，每个浓度每列4孔(n=4)。第一列为对照组。2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色两种细胞培养系培养至第7天后分别行TRAP染色，倒置光镜下观察，计算染色阳性细胞数。全骨髓细胞培养系计算3核以上染色

7、阳性细胞数。观察咖啡酸对破骨细胞及破骨前驱细胞的抑制作用。3统计学分析使用SPSSl6．0软件进行统计学分析。数据处理采用mean±SD检验分析，采用Student’st-tes对不同药物浓度进行相同处理，各组与对照组之间相比较，观察咖啡酸对破骨细胞形成及分化的影响。结果l破骨细胞的形态学特征1．1全骨髓细胞培养系对全骨髓细胞培养系进行TRAP染色后，可见到大量的成熟破骨细胞，其形态学特征表现为：细胞体积大，呈椭圆形、条索状、漏斗形、油煎蛋样或不规则形。胞浆丰富呈紫红色，伸出许多细长的伪足样突起，胞核大，数目多达几个甚至几十个，核仁清晰，胞浆内可见空泡结构

8、。见图(1．4)。1．2破骨前驱细胞培养系经TRAP染色后，可见到