大黄酸对破骨细胞形成、分化及凋亡的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文大黄酸对破骨细胞形成、分化及凋亡的影响姓名：范冠楠申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：唐全勇201203中文摘要大黄酸对破骨细胞形成、分化及凋亡的影响摘要目的：利用小鼠单核细胞RAW264．7细胞株培养系，研究大黄酸对体外诱导培养的破骨细胞形成及分化的影响，同时探讨大黄酸是否通过凋亡途径抑制破骨细胞的形成及分化，为进一步研究大黄酸及破骨细胞提供依据。方法：选用小鼠单核细胞RAW264．7系细胞株，进行体外破骨细胞诱导培养，观察大黄酸对破骨细胞形成、分化的影响，同时通过流式细胞术分析大黄酸对破骨细

2、胞凋亡作用。l细胞培养及药物添加：1．1细胞复苏和培养：取冻存小鼠单核细胞RAW264．7系细胞株1管，在37。C恒温水浴箱中快速复苏，然后移至含有10％胎牛血清的0c．MEM培养液的离心管中离心5分钟(1000转／分)，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的Or,．MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，移至培养瓶中，放置于37。C、5％C02培养箱中培养，待细胞密度达到90％后，用胰酶+EDTA将细胞重悬，收集细胞。将所收集的细胞置于离心机内离心5分钟(1000转／分)，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的仅．MEM培养液，充

3、分吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，计算出细胞原液浓度，然后配制浓度为4．5×104cells／ml的细胞悬液，加入RANKL50ng／ml、M．CSF20ng／ml、青霉素100单位／ml和链霉素100ug／ml。将细胞播种于96孔培养板(4行6列)中，每孔加入浓度为4．5x104cells／ml的细胞悬液150p．L。将培养板置于37。C、5％C02培养箱中培养，培养5天。1．2药物的添加：细胞播种后，在96孔培养板第-Yt为对照组，不添加任何药物。第二至五列加入大黄酸，浓度分别为10一、10～、10一、10

4、击、10～mol／L。．2抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：细胞培养至第5天后行TRAP染色，倒置光镜下观察，计算TRAP染色阳性细胞数。3流式细胞术检测细胞凋亡：中文摘要：各；1细胞培养：用传代细胞继续培养，待瓶底细胞密度达到90％后，用0．25％胰酶+EDTA将细胞重悬，收集细胞。将所收集的细胞移至离心管内离心5分钟(1000转／分)，弃去上清液，加入含10％胎牛血清的仅．MEM培养液，充分吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，计算出细胞原液浓度，然后配制浓度为4．5x104cells／ml的细胞悬液，加入RA

5、NKL50ng／ml、M．CSF20ng／ml、青霉素100单位／ml和链霉素100ug／ml。将细胞播种于24孔板的两孔中，每孔加入浓度为4．5x104cells／ml的细胞悬液5000L。3．2药物的添加：在24孔培养板第一孔为对照组，不添加任何药物。第二孔选取对破骨细胞形成抑制最明显的大黄酸浓度为添加药物组(10。3mol／L)。3．3流式细胞术检测细胞凋亡：细胞培养至第5天后，用0．25％胰酶+EDTA将细胞重悬，分别收集对照组与药物添加组细胞，置于离心机内离心5分钟(1000转／分)，弃去上清液。用4℃PBS缓冲液将细

6、胞重悬，置于离心机内再离心5分钟(1000转／分)，弃去上清液。以3009Llx缓冲液将细胞重悬，每管加入AnnexinV5ul、Pi10ul，静置30分钟，再加入2001a．Llx缓冲液，立刻将细胞置于流式细胞仪检测细胞凋亡。重复流式细胞术检测细胞凋亡3次。4统计学分析：使用SPSSl3．0软件进行统计学分析。数据处理采用非参数检验的方差分析和S．N．K检验，流式细胞结果采用t检验。结果：1破骨细胞的形态学特征细胞培养第一天各组均未见破骨细胞形成；自培养第二天开始对照组可见少量破骨细胞形成，实验组无变化；培养至第三天实验组可见

7、少量破骨细胞形成；培养至第五天，各组均可见到成熟破骨细胞。进行TRAP染色后，光镜下可见到大量成熟的破骨细胞，其形态学特征为：细胞体积较大，呈漏斗形、椭圆形、油煎蛋样、条索状或不规则形。细胞浆丰富，呈紫红色，细胞核较大，数目达几个甚至多达十几个，核仁清晰，有的细胞浆内可见空泡结构。2大黄酸对破骨细胞的形成和分化具有抑制作用，高浓度比低浓度在相同条件下形成的破骨细胞数目少。在小鼠单核细胞RAW264．7系细胞株培养系中，培养板第一列(对照组)没有添加药物，最终破骨细胞形成最多：中文摘要第-N；bn入浓度为100mol／L大黄酸，形

8、成的破骨细胞最少；第三、四、五、六列加入大黄酸的浓度分别为104、10一、10’6、10。1mol／L，最终都有破骨细胞的形成，并且形成破骨细胞的数目较第二列多，并且呈梯度递增，与第一、二列相比统计学有显著性差异(P