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1、植物生理学通讯,一”夕。夕夕“”‘才公。”谷氨酸合酶活力的快速测定郑朝峰林振武中国科学院上海植物生理研究所年活力。依赖铁氧还蛋白的谷氨酸合酶皿,的发现证明植物主要通过谷氨酞胺合成酶谷氨酸合酶途径进行二、试剂与材料。,氨的同化在这个氨同化途径中谷氨酸合酶是限,’‘主】,速酶伽它催化一分子谷氨酞胺和一分子,离子交换柱制备。谷氨酸合酶活力酮戊二酸形成两分子的谷氨酸测离子交换树脂处理及再生阴离子交换树脂采“定的关键是如何把产物谷氨酸与反应液中的其它组用华东化工学院粉末型强酸性阴离子交换,。、万。分尤其是底物谷氨酞胺分开纸层析纸电泳树脂华东化工学院树脂厂商品树脂用℃蒸、
2、、,同位素川氨基酸自动分析和高压液相层析馏水洗一次以除去水溶性杂质及细小颗粒抽干,但作为常规,等技术都曾用来分离谷氨酸测定都不后依次用处理小时蒸馏水洗至中,、,,能令人满意致使该酶的研究一直未能广泛深入性。处理小时水洗至中性醋酸。地开展最近国外用离子交换树脂分离谷氨酸取得℃,再钠处理小时用醋酸洗至流出液中无。、、一了很好的效果这种方法简便易行快速灵敏可为止用检验最后用水洗至中性以,,。,同时测定多个样品而且不需要特殊设备这些备用使用过的树脂经醋酸转型处理后用蒸馏。。都是其它方法所不及的本文建立了用国产阴离子水洗至中性还可重新使用交换树,用改良荀三酮法定量的谷氨
3、,脂分离谷氨酸离子交换柱的制备层析柱为自制的玻璃柱,酸合酶活力测定技术比文献报道的方法灵敏度高即在内径为。的滴管上端接上一个可盛一毫,。。。,三倍多操作也更简便现将该法作一介绍升溶液的喇叭口柱底用少许脱脂药棉作塞子将处“,吸理好的或再生过的树脂与水混合,、取注入层析柱中柱高待水流千后即一基本原理。可上样。不同氨基酸在同一下所带的净电荷的种类提取级冲液每升的‘和数。,缓冲液含克和毫量不同在一范围内谷氨酞胺所带的。净,升琉基乙醉电荷为零而谷氨酸带负电荷时最大为。一当含反应底物谷氨酞胺和产物谷氨酸的酶反应液一酶反应液在中性条件下通过醋酸型阴离子交换树脂谷氨酞胺一,谷
4、氨酞胺不带,,用蒸酮戊二酸柱时电荷不能被树脂吸附馏水即可将它从柱子上洗脱下来,而谷氨酸带负电铁氧还蛋白荷与树脂上吸附的醋酸根离子相互置换而被吸附在碳酸氢钠,当用高浓度的醋酸洗脱时连二亚硫酸钠柱子上它又被醋酸根。一‘离。各种试剂均用的。缓子置换下来这样就将产物谷氨酸与反应物谷氨。。冲液配制并调至用甲基紫精作电酞胺分离开来再用改良荀三酮法测定谷氨酸量,后,就可得子供体测活时用皿甲基紫精代替铁氧还蛋到以产生的谷氨酸量表示的谷氨酸合酶。盆白铁氧还蛋白按钱露萍等的方法,从菠菜叶片本文年月日收到,。今。、中提纯浓度用处的克分子消光系数为本工作在汤玉玮教授指导下完成叶济宇钱
5、露萍。和赵海英协助提纯铁氧还蛋白,邵大森来确定和张混协助高压液,。。。相分析谨此一并致谢布三翻试荆按五等的方法配制,、,内荀三酮总体积为含·、的、、乙醇冰醋酸。蒸馏水这样配制的苟三酮试剂在空气中稳定,在冰箱中可以保存一个月。、三谷氨酸合酶的提取及活力测定石心叫植物材料小麦呈七呈浙,自来麦一号种子用漂白粉表面消毒分钟,置,水浸种小时℃潮湿条件下萌动小时然后将露白的种子均,。匀地摆在尼龙网上用含℃恒温,光强硫酸钙的自来水在室培养眺的提取将培养夭的小麦苗的叶片剪下,一℃冰放低温冰箱中冻若干小时后剪成小段,放在预冷的研钵中加少量石英砂及提取缓冲液研磨,匀浆液经两层纱布
6、过滤后的滤、,,液。。。离心分钟上清液作为粗酶液用于酶︹乃勺。。活力测定提取均在℃以下进行醉活力测定、、,操作步骤反应液各取。置,。℃水浴预保温一分钟,再加。粗酶液,最后加预。印旅保温过的反应液起始反应反应混洗脱管号。合液总体积毫升以不加铁氧还蛋白加。扭。石。磷酸缓冲液代替为对照混合液于℃保图阴离子交换树脂醋酸型对,于沸水浴加热分钟,再剧谷氮酸合酶反应液中谷氮酥脸和谷奴酸的分离温分钟后烈摇动,,待。洗脱图分管收集每管几分钟以终止反应冷后用将调至分管收集洗脱液的纸层析图,然后。。离心分钟。上清液及洗离心展开剂多苯酚显色剂多布三酮的丙酮溶液。管的水全部上离子交换柱
7、等祥品全部进入柱后用。粗酶液蛋白反应及洗脱如前述二,。醋酸依次洗柱子,。最后水洗脱浓丢弃于将洗脱液醋酸浓度由等人的提高到,,。,用醋酸洗脱吸附在柱子上的谷氨酸收集这祥所用洗脱液的量减少另外对也醋酸洗全部洗脱液,直接加色茹三酮试剂,混,匀脱液的分析表明前中没有谷氨酸因此本方后于,,℃水浴保温分钟后立即取出用冰水迅速法仅收集后醋酸洗脱液这样的处理比较,测处的消光系数,,收集冷却对照工作曲线求出等的方法缩短了洗脱时间的洗脱产生的谷氨酸的。,量液体积减少为原来的并且可以直接用荀三酮工作曲线、,。用标准谷氨酸与样品一样上柱洗脱试剂测定不须再从洗脱液中吸取少盆后再作测定和
8、,在。一。户,谷氨酸这样使该法的灵敏度
