酶活力的测定--国标.doc

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1、木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1.三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。2.L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。3.氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。4.盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。0.1mol/

2、L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。5.酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。二、分析步骤1.标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。表1L-酪氨酸标准溶液管号酪氨酸标准溶液（μg/mL）酪氨酸标准储备液体积（mL）加水体积（mL）000101101922028330374404655055分

3、别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。2.样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶

4、液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算：X2=(X1×V×n×8)/(2×m×10)式（1）式（1）中：X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL；X2—样品的酶活力，u/g；V—溶解样品所

5、使用量瓶的体积，mL；n—稀释倍数；8—反应试剂的总体积，mL；2—吸取酶液的体积，mL；m—样品的质量，g；1/10—反应时间10min，以1min计。1、标线的绘制管号酪氨酸的浓度（μg/mL）吸光度A峰所在的波长λ(nm)1100.08502742200.15042743300.23297244400.30112745500.3785274∵吸光度A=1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值∴求得K=134.01352、样品的测定管号吸光度A峰所在的波长λ由标线所得浓度C（μg/mL）空白没有峰平行10.216027328.07平行20.216027328.07