酶活力的测定--国标.doc

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1、木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1.三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g,用水溶解并定容至100mL。2.L-酪氨酸标准储备溶液(100μg/mL)精确称取L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸溶液。吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。3.氢氧化钠溶液(20g/L)称取氢氧化钠2g,加水搅拌溶解。待溶液到室温后,以水定容至100mL,搅拌均匀。4.盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液,加水定容至250ml。0.1mol/

2、L:取1.8ml的浓盐酸溶液,加水定容至200ml。5.酪蛋白溶液(10.0g/L)称取标准酪蛋白1g,用少量氢氧化钠溶液润湿,加入相应的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。二、分析步骤1.标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液:按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。表1L-酪氨酸标准溶液管号酪氨酸标准溶液(μg/mL)酪氨酸标准储备液体积(mL)加水体积(mL)000101101922028330374404655055分

3、别取上述所配的溶液,以0管为空白,利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线。利用回归方程,计算出吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内,如不符合,需重新配制试剂,进行实验。2.样品的测定待测酶液的制备:称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解,定容至50ml。测定:先将酪蛋白溶液置于(40±0.2)℃恒温水浴中,预热5min,然后按以下流程操作:试管A(空白)↓加酶液2.00mL↓(40±0.2)℃,2min加三氯乙酸4.00mL(摇匀)↓(40±0.2)℃,10min加酪蛋白溶

4、液2.00mL(摇匀)↓取出静止10min,过滤(慢速定性滤纸)定容至100ml↓测滤液吸光度试管B(酶试样,需三个平行样)↓加酶液2.00mL↓(40±0.2)℃,2min加酪蛋白溶液2.00mL(摇匀)↓(40±0.2)℃,10min加三氯乙酸4.00mL(摇匀)↓取出静止10min,过滤(慢速定性滤纸)定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算:X2=(X1×V×n×8)/(2×m×10)式(1)式(1)中:X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力,u/mL;X2—样品的酶活力,u/g;V—溶解样品所

5、使用量瓶的体积,mL;n—稀释倍数;8—反应试剂的总体积,mL;2—吸取酶液的体积,mL;m—样品的质量,g;1/10—反应时间10min,以1min计。1、标线的绘制管号酪氨酸的浓度(μg/mL)吸光度A峰所在的波长λ(nm)1100.08502742200.15042743300.23297244400.30112745500.3785274∵吸光度A=1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值∴求得K=134.01352、样品的测定管号吸光度A峰所在的波长λ由标线所得浓度C(μg/mL)空白没有峰平行10.216027328.07平行20.216027328.07

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