淀粉酶活力的测定.doc

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1、淀粉酶活力的测定一、目的学习和掌握测定淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)活力的原理和方法。二、原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3

2、,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下:淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70?15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀

3、粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力)，再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂1(实验材料萌发的小麦种子(芽长约1cm)2(仪器(1)离心机(2)离心管(3)研钵(4)电炉(5)容量瓶:50mL×1,100mL×1(6)恒温水浴(7)20mL具塞刻度试管×13(8)试管架(9)刻度吸管:2mL×3,1mL×2,10mL×1(10)分光光度计3(试剂(均为分析纯)(1)标准麦芽糖溶液(1m

4、g/mL):精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。(2)3,5-二硝基水杨酸试剂:精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用进入。若溶液混浊可过滤后使用。蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2(3)0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液A液:(0.1mol/L柠檬酸):称取CHO?HO21.01，g用蒸馏水溶解并定6872容至1L。B液:(0.1mol/L柠檬酸钠):称取NaCHO?2HO29.41，g用蒸馏

5、水溶解36572并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。(4)1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。四、操作步骤1(麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂:管号试剂1234567麦芽糖标准液(mL)00.20.61.01.41.82.0蒸馏水(mL)2.01.81.41.00.60.20麦芽糖含量(mg)00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸(mL)2.02.02.02.0

6、2.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2(淀粉酶液的制备称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15,20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏

7、水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。2(酶活力的测定:取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。酶活力测定取样表操作项目α-淀粉酶活力测定β-淀粉酶活力测定?-1?-2?-3?-4?-5?-6淀粉酶原液(mL)1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70?水浴15min，冷却淀粉酶稀释液(mL)0001.01.01.03,5-二硝基水杨酸(mL)2.0002.00.0预保温将各试管和

8、淀粉溶液置于40?恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液(mL)1.01.01.01.01.01.0保温在40?恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸(mL)02.02.002.02.0将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。五、结果计算计算?-2、?-3光密度平均值与?-1光密度