酶活力的测定

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1、实验26过氧化氢酶活力的测定（必修）[目的与原理]掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。[试剂与器材]试剂：1、磷酸盐缓冲液（67mmol/l，pH=7.4）：取Na2HP047.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.

2、4。2、基质液（65μmol/l,H2O2）：取30%H2O23.69ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。器材：721分光光度计,0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。[实验步骤]1、样品测定：基质液置于37℃水浴5min，然后按下列步骤操作试剂对照管标准管测定管基质液1.0ml1.0ml1.0ml钼酸铵1.0ml1.0ml—缓冲液—0.2ml—血清0.2ml—0.2ml37℃水浴准确温育60

3、s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。记录各管吸光度值（A）2、计算：过氧化氢酶活力(U/L)=[(A对－A测)/A标]×（65×1×1000/0.2×1000）=[(A对－A测)/A标]×325(式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0mlH2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量，1000为μmol换算成mmol)[方法评估]本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。此法操作简便、准确，在实验时间（1小时）内显色稳定，适于科研和实验检验用。[应用意义]CAT具

4、有重要的生理功能，细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类（如氨基酸氧化酶等）同时存在，能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。此外，CAT清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害，因而有抗衰老和保护作用。[注意事项]1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系，故选用60秒为测定时间（所以本法不宜大批量样品同时测定，以每批4～5份为宜）。2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系；钼酸铵和H2O2呈色反应在pH＜7时吸光度升高，当pH＞7.6时吸光度下降，故选用pH7.4

5、作为测定条件。3、黄色复合物至少在1h内稳定。4、血清不能溶血，溶血样品应该弃去。5、加入钼酸铵后，由于释放O2，气泡会干扰比色，宜在显色10min后比色。[思考题]1、试述过氧化氢酶的测定方法？2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒？3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制？淀粉酶活力的测定（必修）[目的与原理]掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，

6、其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。[试剂与器材]试剂：1、0.04%可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml刻度。此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。2、0.1N

7、碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3)3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。材料：新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。器材：分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。[实验步骤]1、酶提取液的制备取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除

8、脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。2、（见实验蛋白酶活力的测定）2、淀粉酶