1398酶活力的测定.ppt

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1、1398酶活力的测定实验目的学习酶活力测定的原理掌握1398酶活力测定的实验方法酶催化一定化学反应的能力称酶活力。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反应的反应初速度来衡量酶活力的大小。酶活力的测定就是测定酶促反应的初速度。酶活力酶促反应速度通常用在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反应时间作图，得到酶促反应速度曲线。在测定酶促反应速度时，必须在酶促反应初期进行，这段时间内，反应速度称之为反应初速度。在酶促反应速度曲线上，过原点做切线，其斜率即为初速度。IU（internationalenzymeunit）规定：在最适反应条件（25℃，最适缓冲液离

2、子强度和pH值，最适底物浓度）下，每分钟内催化1μmol底物转化成为产物所需要的酶量为一个国际单位，即1IU=1μmol/min。katal（kat）：在最适条件下,每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。1kat=6×107IU国际单位酶活力测定的要求测定初速度最适条件[S]》[E]酶活性的测定方法：终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物的变化量，直接测定出酶反应的初速度。1398中性蛋白酶：由枯草芽胞杆菌经发酵提炼而成的固体酶制剂，能将大分子蛋白质水解成游离的氨基酸等产物。广泛应用于胶片回收、

3、皮革脱毛、丝绸脱胶及医药行业，还可以用于饲料加工。作用温度：35-45℃作用PH：6.5-7.5实验原理1398酶活力越大，水解底物酪蛋白生成的产物酪氨酸含量越多；福林试剂内含有磷钼酸和磷钨酸，在碱性条件下不稳定，可被水解出来的酪氨酸还原生成钼蓝和钨蓝的蓝色物质，从蓝色的深浅通过比色可判断酪氨酸的多少，从而推断酶活力的大小。试剂和器材试剂三氯醋酸（TCA）2%酪蛋白溶液0.02M磷酸缓冲液(PH7.5)Na2CO3福林试剂器材试管，试管架5ml移液管50ml和100ml容量瓶匀浆器、恒温水浴锅分光光度计实验方法酶液的准备倒入小烧杯中，加入少量PBS缓冲液称1398蛋白酶1g用匀浆器

4、磨碎定容至100ml40℃保温15分钟过滤取1ml定容至50ml实验方法123酶液1ml1ml1mlTCA2ml酪蛋白1ml1ml1ml40℃，pH7.5，10minTCA2ml2ml40℃，10min，过滤滤液1ml1ml1mlNa2CO35ml5ml5ml福林试剂1ml1ml1ml40℃，20min，显色OD650nm注意事项：所加的酪蛋白溶液须在40℃恒温水浴中预热2分钟酶活力计算酶活力=酪氨酸的微克数××N酪氨酸的微克数：从标准曲线上查得N：酶液稀释倍数4：从4ml中取出1ml滤液用于反应10：反应时间10min实验方法123酶液1ml1ml1mlTCA2ml酪蛋白1ml1

5、ml1ml40℃，pH7.5，10minTCA2ml2ml40℃，10min，过滤滤液1ml1ml1mlNa2CO35ml5ml5ml福林试剂1ml1ml1ml40℃，20min，显色OD650nm实验方法酶液的准备倒入小烧杯中，加入少量PBS缓冲液称1398蛋白酶1g用匀浆器磨碎定容至100ml40℃保温15分钟过滤取1ml定容至50ml