《蛋白酶活力测定》PPT课件

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1、蛋白酶活力测定一、概述二、测定原理三、试剂四、操作手续五、计算六、注意事项一、概述1．什么是酶？2．影响酶催化反应的因素3．什么是酶的活力?4．测定意义5.测定方法生物催化剂特殊催化功能的蛋白质酶的特性:（1）作用有专一性、选择性（2）催化速度快（3）反应条件温和（4）化学本质是蛋白质一种酶只作用一种底物：淀粉酶：只能催化淀粉水解→糊精、低聚糖；蛋白酶：只能催化蛋白质水解→氨基酸、肽；在激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发生改变。而变性，失去催化能力这种现象叫做酶的失活底物浓度pH温度时间VVmax底物浓度CC0饱和浓度底物浓度OD

2、pHpH最适溶液pH的影响酶的分类酸性蛋白酶3350pH最适=2～4；7401pH最适=3.0中性蛋白酶1398pH最适=7～7.5；166pH最适=7～8碱性蛋白酶2709pH最适=9～11；209pH最适=9.5～11ODT（℃）T最适温度的影响3350：T最适：45℃-47℃40℃以下稳定1398：T最适：30℃-37℃（pH：6.0-6.5）T最适：40℃-50℃（pH：7.0-7.5）2709：T最适：45℃-55℃40℃以下稳定。Q（反应物的消耗量或生成物的生成量)t0t作用时间的影响oAdQdtKdQdtv结论酶催化反应在反应初速度时间内最适温度最适pH饱

3、合底物浓度在最大活力处比较在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。表示为：单位/g或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5万单位，即：50000μg/g=0.05g酪氨酸/1g酶粉。蛋白酶的活力定义：测定意义生皮蛋白质胶原蛋白（80%-85%）非胶原蛋白弹性蛋白网硬蛋白间质蛋白酶的活力会下降酶的催化能力强测定方法乙醇滴定法、甲醛滴定法等Folin-酚法，紫外分光光度法，残氮量测定法等等。Gross法、明胶粘度下降法、凝乳作用法酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋白酶原激活作用的大小

4、来表示。福林试剂，在碱性情况下极不稳定。可被酚类化合物还原，而呈蓝色反应。由于蛋白质或水解产物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈这个反应，因此可以利用这个原理来测定蛋白酶活性的强弱。二、测定原理1．酶催化反应酪蛋白酶催化条件酪氨酸白色至黄色粉沫，无臭无味，溶于稀碱、浓酸，在弱酸中沉淀，几乎不溶于水，有吸湿性，干燥时稳定，潮湿时迅速变质。条件：底物浓度温度pH时间选择：C0T最适pH最适t0措施：C≥C0恒温水浴缓冲溶液t=t0例子：5370.5%酪蛋白40℃3.010min例子：13980.5%酪蛋白40℃7.510min例子：27090.5%酪蛋白40℃101

5、0min2.显色反应福林试剂+酪氨酸OH-HO——CH2—CH—COOH还原性NH2钼蓝+钨蓝蓝色物质显色剂Na2WO4Na2MoO4H2OH3PO4福林试剂→HCLLi2SO4Br2显色剂亮金黄色3．朗伯-比尔定律及其应用E——吸光度A——消光值OD——光密度E=K·Ｃ·L=lg（I0/I）=K′·C透光率T=II0入射光强度I0透过光强度I有色真溶液CL朗伯-比尔定律的应用[X]→[RX]→OD被测组分的浓度与光密度OD成直线关系[X]ODOD=K·C[RX]OD=K′·C[X]①选择λmax注意:λmax=680nm②OD值的范围OD=0.2～0.6OD=0.43

6、4．制作标准曲线酪氨酸浓度CODC1OD1C2OD2C3OD3······CnODn福林—酚法测定蛋白酶活力方法要点配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入福林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。三、试剂10﹪CL3CCOOH水溶液0.55mol/L碳酸钠溶液缓冲溶液福林试剂显色剂一种杂多酸磷钼酸H

7、3[P（Mo3O10）4]磷钨酸H3[P（W3O10）4]福林试剂的配制Na2WO4·2H2O100gNa2MoO4·2H2o25gLi2SO450gH2O100ml10hr+85﹪H3PO450mlH2O50ml浓HCL100ml混匀+溴水15`冷却→黄色→过滤Δ回流Δ金黄色溶液(1)柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液pH=3.0A液：0.1mol/L柠檬酸21.01gC6H8O7·H2O→1000mlCH2—COOHHO—C—COOHCH2—COOHB液：0.1mol/L柠檬酸纳29.4gNa3C6H5O7·2H2O→1000ml用时：A∶B=