资源描述：
《蛋白酶活力测定法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、备案号:2744-1999中华人民共和国行业标准/x10317-1创冲蛋白酶活力测定替ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。福林法1.1试剂及溶液:以下试剂都为分析纯1.1.1福林试剂(Folin试剂}:于20OOmL磨口回流装置内，加入钨酸钠.(NapWO,-2H,O)100g,钥酸钠(Na,MoO,·2H,O)25g,蒸馏水700mL,850o磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流loh。取去冷凝器，加入硫酸铿(Li多04)5馆，蒸馏水50mL,混匀，
2、加人几滴液体澳，再煮沸15min，以驱逐残澳及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴澳液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗〔No4^5)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.20.4mol碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na,COO42.48，定容至1000mL,1.1.30.4mol三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL,COOH)65.4g，定容至1000mL,1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·214,0)31.跄，定容至1000mL
3、，即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na,HPO,·12H}O)71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(B液).取A液28mL和B液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.lmolpH7.2的磷酸盐缓冲液.1.1.52%酪蛋白溶液:准确称取干酪素第，称准至0.0028.加入0.1N氢氧化钠lOmL在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至lOOmL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质.1.1.6100pg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸。.1
4、00馆，逐步加入6raLlN盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至JOOmL，其浓度为1000pg/mL，再吸取此液lOmL,以0.2N盐酸定容至100mL，即配成100pg/mL的酩氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。1.2仪器a.分析天平:感量0.lmg;b.581-G型光电比色计或72型分光光度计;c.水浴锅;d.1,2,5,100mL移液管等。1.3操作国欢国内搜易局1999-04-15批准999-04-15实施230SB111璐17-1创冷1.3.1标准曲线的绘制1.3-1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)
5、,表1配制各种不同浓度的酪氮酸溶液管号试剂123456蒸馏水..L1086420100pg/mL酪氨酸，mL0246810酪氨酸最终浓度，pg/mL0204060801001.3.1.2测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mo1碳酸钠5mL,再各加人已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD)(滤色片用65")或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次，取平均值。将1^-6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密
6、度为净OD数。为了清楚起见，再列出表格如下(表2),表2管号试剂123456按表1制备的不同浓度酪氨酸，mL1111110.4mo1/LNa2C0=mL555555福林试剂，mL’11111112OD值3平均净OD值0以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K),1.3.2样品稀释液的制备。1.3-2.1测定酶制剂:称取酶粉。.100g，加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL，吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL，即成5000倍的酶粉稀释液。1.3.2.2测定成曲酶:称取充分研细的成曲5g，加水至10
7、0mL，在40℃水浴内间断搅拌lh，过滤，滤液用0.lmolpH7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.3.3样品测定:取15X100m。试管3支，编号1,2,3(做2只也可)，每管内加入样品稀释掖1mL,置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温lOmin，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15X150mm试管3支，编号l,2,3，每管内加入滤液1mL，再加。.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL摇匀，40℃
8、保温发色20min后进行光密度(OD)测定。231S
