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1、中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法SB/T10317-1999Measurementofproteinaseactivity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1福林法1.1试剂及溶液:以下试剂都为分析纯1.1.1福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸10
2、0mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.20.4mol碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.30.4mol三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3
3、COOH)65.4g,定容至1000mL。1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.52%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加
4、热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2仪器a.分析天平:感量0.1mg;b.581-G
5、型光电比色计或72型分光光度计;c.水浴锅;d.1、2、5、10mL移液管等。1.3操作1.3.1标准曲线的绘制1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━蒸馏水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10酪氨酸最终浓度,μg/m
6、l┃0┃20┃40┃60┃80┃100━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━1.3.1.2测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD)(滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。为了
7、清楚起见。再列出表格如下(表2)。表2━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━0.4mol/LNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━福林试剂,mL
8、┃1┃1┃1┃1┃1┃1━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃1┃┃┃┃┃┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃2┃┃┃┃┃┃OD值┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃3┃┃┃┃┃┃┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━┃平均┃┃┃┃┃┃━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━净OD值┃0┃┃┃┃┃━━━━━━━━━━━━━━━┻
