淀粉酶活力的测定.ppt

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1、实验七　淀粉酶活力的测定一、实验目的掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法二、实验原理酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37℃、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37℃、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需要的酶量。1U=1mg还原糖/min·m

2、L酶三.实验材料及设备1、材料淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液）2、仪器分光光度计  恒温水浴  沸水浴3、器材刻度试管：25mL×17移 液 管：1mL×3（取稀释后的酶液）烧    杯：250mL×1滴    管：2洗 耳 球：2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1移液器：专取NaOH注射器：专取蛋白样品四、试剂的配制1、淀粉溶液（0.5%）称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）3、磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH6.8），含0.3%NaCl4、NaOH溶液（2.5mol/L）五.操作步骤1、淀粉酶的制备（

3、1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗酶提取液解冻，取上清液0.05mL，加蒸馏水稀释到25mL，摇匀备用（2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻，取上清液0.05mL，加蒸馏水稀释到25mL，摇匀备用（3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取0.05mL，稀释。收集1管的同学，将0.05mL稀释到15mL收集2管的同学，将0.05mL稀释到10mL试管排列顺序空白F1B3B2F3F2F1B3B2B1F3F21淀粉32B1粗酶液盐析脱盐0时刻5min时刻装约20mL淀粉溶液，标记，转至37℃水浴锅中因淀粉中含有少量还原糖，

4、某些溶液有色素、杂质，需查看酶不水解淀粉的情况37℃室温实验编号操作0号管粗酶液(1)盐析液(2)脱盐液(3)0时刻5min时刻0时刻5min时刻0时刻5min时刻B1B1’F1F1’B2B2’F2F2’B3B3’F3F3’淀粉酶液(ml)0.30.20.5H2O(ml)3.5pH6.8缓冲液各1ml0.3％NaCl各1ml预热摇匀，37℃水浴2minNaOH(ml)111111预热的淀粉各1ml，迅速摇匀酶促反应37℃水浴5min(准确计时)NaOH(ml)111111DNS试剂各2ml，摇匀显色反应沸水浴5min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀比色以0

5、号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值记录A540六.结果处理1、分别计算0时刻、5min时刻的A540nm平均值。2、根据图表中的实验结果，并利用实验“3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线，计算淀粉酶的活力。需要详细过程。5min时刻吸光值0min时刻吸光值5min时刻还原糖mg数0min时刻还原糖mg数二者相减，计算酶活力。1U=1mg还原糖/min·mL酶*稀释倍数七.思考题1、在测定酶活力时应注意哪些反应条件？为什么？2、本实验中两次加入NaOH溶液的意义是什么?八、分析1.三种酶活力大小顺序是怎样，为什么是这样？2.酶液的

6、稀释倍数是否要改变。3.计算酶液的总活力、回收率。