酶活力测定方法的研究

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1、酶活力测定方法的研究——淀粉酶活性的测定一、研究背景酶Enzyme,指具有生物催化功能的高分子物质。酶通过降低化学反应的活化能来加快反应速率，因而具有高效性，同时酶具有高度的专一性。酶的催化活性可以受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗牛素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。淀粉酶是一类水解淀粉的糖甘键的总称，按

2、照其水解淀粉的方式，可以分为a■淀粉酶和B■淀粉酶等。a■淀粉酶是一种内切葡萄糖昔酶，催化水解a-l/4-糖背键，生成a■麦芽糖和少量葡萄糖。B•淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断a-1,4-葡聚糖链。对于象直链淀粉能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至□-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。二、研究目标1.掌握酶活力的测定方法2.进一步学会设计实验方案3.测定—淀粉酶和B■淀粉酶的活性三、研究策略酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。实验的总体思路是

3、测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。1.酶的获取淀粉酶广泛存在于禾谷物类的种子屮a■淀粉酶是在萌发的过程屮产牛的。所以収萌发的种子浸提获取酶溶液。2.反应过程B■淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而a■淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化。尽管在种子的萌发过程中，提取液中同时含有两种淀粉酶,可利用这两种淀粉酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另外一种酶的活力。3•产物的检测淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用还原糖的3,5■二硝基水杨酸法测定。四、研究方案及可行性分析研究方案：a•淀粉酶耐高温，而B■淀粉酶在高温下易失活。可以在适当的高温下水

4、浴，使B■淀粉酶失去活性，而a■淀粉酶的活性不受很大的影响，这样分解的淀粉可以认为是a■淀粉酶催化的产物。同时可以测量a■淀粉酶和B■淀粉酶的总活力，从而推出P■淀粉酶的活力。可行性分析：温度可以通过恒温水浴来实现。试剂等都是实验室常见的，仪器实验室也有。五、具体实验设计1、所用相关试剂：1%淀粉溶液，PH5.6的柠檬缓冲液，3,5■二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，0.4MNaOH2、相关仪器:分光光度计，水浴锅，离心机3、实验步骤：(1)酶液的制备称取2g萌发的小麦种子；研蘑成匀浆；转移到50ml容量瓶屮至40ml左右，室温浸提15-20mi

5、n后定容；混匀后3500rpm/min,离心20min,取上清液备用(3)a■淀粉酶及B•淀粉酶总活性的测定(4)麦芽糖的测定a■淀粉酶活性[(mg/g)/(g/min)]=[(A-A,)*样品稀释总体积]/[(样品重g)*5](a・+B・)淀粉酶总活性[(mg/g)/(g/min)]二[(B・B')*样品稀释总体积]/[(样品重押5]A——a■淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A'——Q•淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B——(a・+B・)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度B'—一(a・+B・)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度六、质疑及相关思考酶的活力主要体现在初速

6、度上，应该如何控制反应时间，从而得出的结果为酶促反应的初速度。高温条件下B■淀粉酶的活性是否被完全抑制，同时a■淀粉酶的活性是否没有改变。七、思考题1•酶活力测定实验的总体思路你认为应该是什么？酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。而且酶促反应的初速度才是反应酶活的指标。2•由上述总体思路你认为酶活力测定实验屮最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？影响酶活力的因素很多，要测定酶的活力就需要创造合适的条件。材料中有两种淀粉酶，本实验的关键是如何抑制一种酶

7、的活性，而另一种酶的活性没冇太大改变。在实验的过程中，水浴的时间一定要到位，如果干扰酶的活性没有被完全抑制，则会严重影响实验结果。3•淀粉酶和转氨酶的作用各自有何特点？在设计其酶活力测定的具体实验方案时，你认为主要应该有哪些针对性的考虑？淀粉酶和转氨酶属于不同类型的酶。淀粉酶是水解淀粉的糖昔键的一类酶，转氨酶是催化a■酮酸和a■氨基酸Z间转氨作用的酶，它们产物不同，最适条件不同。保证在最适温度，pH等条件下测定其酶活力。1.酶促反应的特点？规定酶活力单位的作用？酶活力单位想表征的内涵是什么？其规定有什么特点？酶具有高效性和专一性，同时要求温

8、和的反应条件。规定酶活力单位可定量表示酶的催化效率。一个酶活力单位，是指在最适条件下（25?C,最适pH,充足底物），每分钟内能催化1Umol底物所需要的酶量。酶活力单位可以用于