实验二酶活力测定方法的研究

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1、实验二酶活力测定方法以及水溶性蛋白含量的测定一．研究背景及目的酶是催化生物体内生化反应的重要成分，它可以在常温常压下非常高效的催化化学反应。对于酶，我们最关注的的就是它的活性。在实验中，当我们做酶实验时，只有知道自己在做的酶是有活性的，我们后续的工作才有可能继续。在实验室购买特定的酶时，我们关注的不是购买的重量，而是购买到的酶活性有多少，能催化多少摩尔的化学反应。掌握酶催化的活性也有利于我们估计反应需要进行的时间。甚至在我们改造酶结构的时候，也许要一个标准证明我们的改造是有效的。这一切，都需要我们能够测定酶的活性。本实验的目的就是设计实验，合理的测定酶活力

2、。体会在不同的酶中，具体的实验设计步骤是否相同；学会根据不同酶的特点，设计其酶活力的测定方法；探究酶活力测定的基本原则。二．原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。禾谷类种子的萌发时可快速将淀粉转变成葡萄糖，由此我们推断禾谷类种子中存在不止一种淀粉酶，一种是我们熟知的β-淀粉酶，它可从淀粉还原性末端切掉葡萄糖。另一种α-淀粉酶它既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α-1，4-链。休眠的种子中就只有β-淀粉酶的存在，α-淀粉酶是在和粽子萌发的过程中形成的。α-淀粉酶和β-淀粉酶各有其一定的特性。β-淀粉酶不耐热，在高温下容易发生

3、钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下时发生钝化。在萌发的种子中，这两种淀粉酶同时存在。想要测定其中一种酶的活性，就要设法钝化另一种酶。该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。通过3,5－二硝基水杨酸比色法确定催化产麦芽糖的含量。三．仪器与试剂1.仪器：低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）722分光光度计（上海分析仪器总厂）；40℃水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；70℃水浴锅（电热恒温水浴锅，天津市中环实验电炉有限公司）；药物天平（HCTP12B1，北京宣武

4、天平厂制）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;研钵；50ml容量瓶；100ml容量瓶。2.试剂：pH5.6的柠檬酸缓冲液；3,5-二硝基水杨酸溶液;麦芽糖标准液（1mg/ml）；0.4MNaOH；试剂甲；试剂乙；牛血清蛋白标准液（250μg/ml）3.材料：萌发的小麦种子（苗长约1cm）一．实验步骤（1）.酶液的制备（蒸馏水浸提）：称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取

5、出上清液备用（初始酶液）。（2）α－淀粉酶活性的测定：按下表进行操作：试剂试管编号1234测定管对照管酶提取液各1ml，在70℃水浴中准确加热15min（使β-淀粉酶钝化），取出后立即在冰浴中冷却pH5.6的柠檬酸缓冲液各1ml，然后再40℃恒温水浴中准确保温15min0.4MNaOH溶液各4ml将试管至于40℃恒温箱水浴15min淀粉溶液各2ml，混匀，立即置于40℃水浴中准确计时5min0.4MNaOH溶液加入4ml各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却蒸馏水将每支试

6、管中的溶液稀释到15ml，混匀（3）α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。按下表进行操作：试剂试管编号1234测定管对照管酶提取液、pH5.6的柠檬酸缓冲液每个试管，两种液体各1ml，在40℃恒温水浴中准确保温15min0.4MNaOH溶液各4ml淀粉溶液各2ml，混匀，立即置于40℃水浴中准确计时5min0.4MNaOH溶液加入4ml各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却蒸馏水将每支试管中的溶液稀释到15ml，混匀

7、（4）麦芽糖的测定：a.标准曲线的制作：管号1234567麦芽糖标准液（ml）00.10.30.50.70.91.0蒸馏水（ml）1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水杨酸各1ml,摇匀，沸水浴中保持5min取出冷却后，蒸馏水稀释到15ml。用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。b.样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在

8、520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。