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《应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、第30卷第3期暨南大学学报(自然科学版)Vo.l30No.32009年6月JournalofJinanUniversity(NaturalScience)Jun.2009应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法万艳,李丽玲,陈小佳(暨南大学生物工程研究所,广东广州510632)[摘要]介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Rea-lTimePCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数
2、.结果表明:以转染sPDGFRA基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性15范围(10-10拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.[关键词]外源基因;拷贝数;实时定量PCR[中图分类号]R735.7[文献标识码]A[文章编号]1000-9965(2009)03-0310-04Anewmethodtoteterminethecopynumberso
3、fexogenousgenebyabsolutequantitativeRea-lTimePCRassayWANYan,LIL-iling,CHENXiao-jia(BioengineeringInstituteofJinanUniversity,Guangzhou510632,China)[Abstract]Toexploreanewmethodtodeterminethecopynumbersofexogenousgeneclonedinmam-malcellgenomebyusingtheabsolutequantitativeRea-
4、lTimePCR.Firstly,withspecificprimerstoam-plythetargetgene,thestandardsamplesweresetup.Then,toamplytheexogenousgeneinrecombinantmammalcellgenomebyRea-lTimePCR.Comparetostandardsamples,theircopynumbersweredeter-mined.TheresultsshowthattotakeexogenoussPDGFRAasexample,itscopynu
5、mbersinCHO-K1ge-nomeweredetermined.InRea-ltimePCRresults,standardcurveshowedaverygoodlinearrelationship1betweenthresholdcycle(Ct)andstartingquantityofcopynumber.Thedetectionrangewasfrom10to510copiesperreaction.DifferentrecombinantCHO-K1celllineshavedifferentexogenoussPDGFRA
6、copynumbers.Furthermore,theresultsindicatedahighstabilityandreproducibilityofexamplesaccord-ingtothreeindependentexperiments.Comparewithtraditionalhybridizationassayssuchassouthernblo,titisamoreefficientandconvenientmethodtoestimatecopynumbersingenome.[Keywords]exogenousgen
7、e;copynumber;Rea-lTimePCR哺乳动物细胞表达外源蛋白是基因工程制药研需经过重组表达载体的设计构建,转染,筛选和鉴定究中的一个重要内容,一般而言,重组细胞株的获得等一系列步骤.目前鉴定工作主要集中在测定外源[收稿日期]2008-12-31[基金项目]广东省科技攻关项目(200813030301349)[作者简介]万艳(1982-),女,硕士研究生,研究方向:基因工程制药通讯作者:陈小佳,Te:l020-85220220;电子邮件:Carolcx@jmsn.cn第3期万艳,等:应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法
8、311基因的表达水平,寻找高效表达的重组细胞株.由应条件为:65e5min,30e10min,42e60min,于在转染过程中,外源DNA被随机插入宿主细胞基72e
